मोबाइल एकल अणु FRET जांच के स्वचालित दो आयामी Spatiotemporal विश्लेषण

Summary

यह लेख मोबाइल, एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) के spatiotemporal विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है- वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके आधारित जांच। नव विकसित सॉफ्टवेयर टूलकिट समय के कार्यों के रूप में सही FRET दक्षता और आणविक पदों सहित चलती जांच के smFRET समय के निशान के निर्धारण की अनुमति देता है।

Abstract

एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) एक बहुमुखी तकनीक नैनोमीटर रेंज के लिए उप-नैनोमीटर में दूरी पर रिपोर्टिंग है। इसका उपयोग बायोफिजिकल और आणविक जैविक प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया गया है, जिसमें आणविक बलों का माप, बायोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक गतिशीलता का लक्षण वर्णन, प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर कोलोकलाइजेशन का अवलोकन और रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन समय का निर्धारण शामिल है। एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी कॉन्फ़िगरेशन में, प्रयोग आमतौर पर सतह-स्थिर जांच का उपयोग करके किए जाते हैं। यहां, वैकल्पिक उत्तेजना (एलेक्स) smFRET प्रयोगों के साथ एकल-अणु ट्रैकिंग के संयोजन की एक विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्लाज्मा झिल्ली या ग्लास-समर्थित लिपिड बाईलेयर में सतह-बाध्य, फिर भी मोबाइल जांच के smFRET समय के निशान के अधिग्रहण की अनुमति देती है। रिकॉर्ड किए गए डेटा के विश्लेषण के लिए, एक स्वचालित, ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर संग्रह विकसित किया गया था जो (i) फ्लोरोसेंट संकेतों का स्थानीयकरण, (ii) एकल-कण ट्रैकिंग, (iii) सुधार कारकों सहित FRET-संबंधित मात्राओं का निर्धारण, (iv) smFRET निशान का कठोर सत्यापन, और (v) परिणामों की सहज ज्ञान युक्त प्रस्तुति का समर्थन करता है। उत्पन्न डेटा को विशेष सॉफ़्टवेयर के माध्यम से आगे की खोज के लिए इनपुट के रूप में आसानी से उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जांच के प्रसार व्यवहार के मूल्यांकन या FRET संक्रमण की जांच के लिए।

Introduction

Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आणविक जैविक और biophysical अनुसंधान में एक प्रमुख चालक रहा है, क्योंकि यह उप-नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर प्रक्रियाओं की जांच की अनुमति देता है। चूंकि दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस के बीच ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता दृढ़ता से नैनोमीटर रेंज के लिए उप-नैनोमीटर में अंतर-डाई दूरी पर निर्भर करती है, इसलिए इसका उपयोग बायोमोलेक्यूल्स ^1,2,3,4 की स्थिर और गतिशील संरचना का पता लगाने के लिए एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासक के रूप में प्रभावी रूप से किया गया ^है। इसके अतिरिक्त, FRET घटना व्यापक रूप से एक थोक स्तर पर झिल्ली से जुड़े और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के colocalization अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया ^है5,6. पिछले दो दशकों में, इस विधि को smFRET ^events7 की निगरानी के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसने अस्थायी और स्थानिक संकल्प को काफी हद तक बढ़ाने में मदद की और विषम नमूनों में दुर्लभ उप-आबादी को भी हल किया। इन तकनीकों से सुसज्जित, अद्वितीय अंतर्दृष्टि को आणविक मशीनरी की गतिशीलता में प्राप्त किया गया था जैसे कि आरएनए पोलीमरेज़ ^II8 की प्रतिलेख प्रसंस्करण दर, डीएनए पोलीमरेज़ ^9,10 की प्रतिकृति गति, न्यूक्लियोसोम ट्रांसलोकेशन दर ¹¹, ट्रांसक्रिप्ट स्प्लिसिंग और असेंबल किए गए स्प्लिसोसोम ¹² की स्टालिंग दर, राइबोसोमल सबपॉपुलेशन ¹³ की गतिविधि, और किनेसिन मोटर्स की चलने की गति ¹⁴ , कुछ नाम देने के लिए। रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन ^durations15 और आणविक बलों ¹⁶ की मात्रा निर्धारित की गई है।

तीव्रता-आधारित smFRET अध्ययन आमतौर पर FRET दक्षता को मापने के लिए संवेदनशील उत्सर्जन पर भरोसा करते हैं: उत्सर्जन पथ में एक बीम विभाजक स्थानिक रूप से दाता से उत्पन्न प्रकाश को अलग करता है और दाता उत्तेजना पर स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस से उत्पन्न होता है, जिससे व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिमाणीकरण की अनुमति मिलती है। दक्षता की गणना बाद में कुल फोटॉन गणना ¹⁷ के संबंध में स्वीकर्ता द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों के अंश के रूप में की जा सकती है। इसके अलावा, दाता उत्तेजना (एलेक्स) के बाद स्वीकर्ता उत्तेजना FRET घटनाओं के stoichiometry के माप की अनुमति देता है, उत्पन्न होने वाले संकेतों से सही कम FRET संकेतों के बीच भेदभाव में सहायता करता है, उदाहरण के लिए, एक photobleached स्वीकर्ता ^{fluorophore18} की विशेषता जांच से।

एकल-अणु FRET प्रयोग आमतौर पर दो तरीकों में से एक में किए जाते हैं। सबसे पहले, नमूना मात्रा में एक छोटे से क्षेत्र को एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रकाशित किया जाता है। समाधान में एकल जांच अणु उत्साहित होते हैं जब वे फोकल वॉल्यूम के भीतर फैलते हैं। इस तकनीक के साथ, तेजी से फोटॉन-गिनती डिटेक्टरों का उपयोग किया जा सकता है, जिससे उप-माइक्रोसेकंड टाइम रिज़ॉल्यूशन सक्षम हो सकता है। दूसरा, जांच को विशेष रूप से सतहों पर स्थिर किया जाता है और वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के माध्यम से निगरानी की जाती है, अक्सर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब (टीआईआर) कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग किया जाता है। जांच immobilization पहले दृष्टिकोण का उपयोग करने की तुलना में बहुत लंबे समय तक रिकॉर्डिंग समय के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, दृश्य का बड़ा क्षेत्र समानांतर में कई जांचों की निगरानी की अनुमति देता है। एक कैमरे की आवश्यकता इस विधि को ऊपर वर्णित एक की तुलना में धीमा बनाती है। समय रिज़ॉल्यूशन मिलीसेकंड से दूसरी श्रेणी तक सीमित है.

यदि लंबे समय के निशान की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, एक मिलीसेकंड से दूसरी बार के पैमाने पर गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, पहली विधि लागू नहीं होती है, क्योंकि प्रतिदीप्ति फटने आमतौर पर बहुत कम होते हैं। दूसरा दृष्टिकोण विफल हो जाता है जब भी स्थिरीकरण संभव नहीं होता है, उदाहरण के लिए, लाइव-सेल प्रयोगों में कोशिका झिल्ली के भीतर जांच की विशेषता होती है। इसके अलावा, यह देखा गया है कि जैविक मॉडल सिस्टम संपर्क की गई सतह ¹⁶ की गतिशीलता के आधार पर नाटकीय रूप से अपनी प्रतिक्रिया को बदल सकते हैं।

जबकि संयुक्त smFRET और एकल कण ट्रैकिंग प्रयोगों मोबाइल FRET जांच रिकॉर्डिंग पिछले ¹⁹ में प्रदर्शन किया गया है, वहाँ डेटा के मूल्यांकन के लिए कोई सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर है. इसने एक नए विश्लेषण मंच के विकास को प्रेरित किया, जो मोबाइल फ्लोरोसेंट जांच के कई गुणों के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, जिसमें smFRET दक्षता और स्टोइकोमेट्री, उप-पिक्सेल सटीकता के साथ स्थिति, और समय के कार्यों के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता शामिल है। चरणबद्ध ब्लीचिंग व्यवहार, निकटतम-पड़ोसी दूरी, उत्सर्जन तीव्रता, और अन्य लक्षणों की जांच करके परिणामी निशान को फ़िल्टर करने के तरीके विशेष रूप से सही ढंग से संश्लेषित और कार्यात्मक एकल-जांच अणुओं को चुनने के लिए स्थापित किए गए थे। सॉफ्टवेयर भी प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक तकनीकों का समर्थन करता है हाल ही में विश्वसनीय, मात्रात्मक smFRET ^data17 का उत्पादन करने के लिए एक multilaboratory अध्ययन में सहमत हुए. विशेष रूप से, कार्यान्वयन FRET दक्षता और stoichiometry की गणना के लिए मान्य प्रक्रियाओं का पालन करता है। दाता उत्सर्जन चैनल _{आईडीडी} और स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल _{आईडीए} में दाता उत्तेजना पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग Eq (1) का उपयोग करके स्पष्ट FRET दक्षता Eapp की गणना के लिए किया जाता है।

(1)

स्वीकर्ता उत्तेजना IAA पर स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता की मदद से, स्पष्ट stoichiometry Eq (2) का उपयोग करके गणना की जाती है।

(2)

FRET दक्षता E और stoichiometry S को चार सुधार कारकों पर विचार करके Eapp और Sapp से प्राप्त किया जा सकता है।

α स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल में दाता प्रतिदीप्ति के रिसाव का वर्णन करता है और केवल दाता फ्लोरोफोरस युक्त नमूने का उपयोग करके या प्रक्षेपवक्र के कुछ हिस्सों का विश्लेषण करके निर्धारित किया जा सकता है जहां स्वीकर्ता को ब्लीच किया गया है। δ दाता उत्तेजना प्रकाश स्रोत द्वारा स्वीकर्ता की प्रत्यक्ष उत्तेजना के लिए सही करता है और केवल स्वीकर्ता fluorophores के साथ एक नमूने का उपयोग करके या प्रक्षेपवक्र के कुछ हिस्सों का विश्लेषण करके मापा जा सकता है जहां दाता को ब्लीच किया गया है।

.

γ दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनलों और फ्लोरोफोर की विभिन्न क्वांटम दक्षताओं में अलग-अलग पहचान क्षमताओं को सुधारने के लिए आईडीडी को तराजू करता है। कारक उच्च FRET दक्षता ²⁰ के साथ trajectories में स्वीकर्ता विरंजन पर दाता तीव्रता में वृद्धि का विश्लेषण करके या कई असतत FRET राज्यों की विशेषता वाले नमूने का अध्ययन करके गणना की जा सकती है।

β दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना की असमान क्षमताओं के लिए सही करने के लिए आईएए को तराजू करता है। यदि γ स्वीकर्ता ब्लीचिंग विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया गया था, तो β की गणना ज्ञात दाता-से-स्वीकर्ता अनुपात ²¹ के नमूने से की जा सकती है। अन्यथा, बहु-राज्य FRET नमूना भी β पैदावार.

साथ में, सुधार Eq (3) का उपयोग करके सही FRET दक्षता की गणना की अनुमति देते हैं।

(3)

और Eq (4) का उपयोग कर सही stoichiometry.

(4)

आदर्श रूप से, 1: 1 दाता-से-स्वीकर्ता अनुपात के लिए सही स्टोइकोमेट्री एस = 0.5 देता है। व्यवहार में, एक कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात एस के मापा मूल्यों का प्रसार पैदा करता है, जो दाता-केवल संकेतों (एस = 1) और स्वीकर्ता-केवल संकेतों (एस = 0) से भेदभाव को बाधित करता है। परिणामी समय के निशान का उपयोग एकल-अणु प्रक्षेपवक्रों के अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए इनपुट के रूप में किया जा सकता है ताकि स्पैटिओटेम्पोरल फोर्स प्रोफाइल ¹⁶, एकल-अणु घटनाओं की गतिशीलता ²², या ^{विभिन्न राज्यों के} बीच संक्रमण कैनेटीक्स जैसी जानकारी प्राप्त की जा सके।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल smFRET ट्रैकिंग प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों और प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, साथ ही साथ नए विकसित सॉफ़्टवेयर सूट का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के पीछे के कार्य सिद्धांत का वर्णन करता है। प्रयोगात्मक डेटा के अधिग्रहण के लिए, निम्नलिखित आवश्यकताओं को पूरा करने वाले माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है: i) एकल डाई अणुओं के उत्सर्जन का पता लगाने की क्षमता; ii) वाइडफील्ड रोशनी: विशेष रूप से लाइव-सेल प्रयोगों के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR23,24,25) कॉन्फ़िगरेशन की सिफारिश की जाती है; iii) तरंग दैर्ध्य के अनुसार उत्सर्जन प्रकाश का स्थानिक पृथक्करण जैसे कि दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति को एक ही कैमरा चिप ²⁵ या विभिन्न कैमरों के विभिन्न क्षेत्रों पर प्रक्षेपित किया जाता है; iv) मिलीसेकंड परिशुद्धता के साथ दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना के लिए प्रकाश स्रोतों का मॉडुलन, उदाहरण के लिए, एकोस्टो-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर के माध्यम से सीधे मॉड्युलेटेबल लेजर या मॉडुलन का उपयोग करना। यह स्ट्रोबोस्कोपिक रोशनी को फ्लोरोफोर के फोटोब्लीचिंग को कम करने के साथ-साथ स्टोइकोमेट्री निर्धारित करने के लिए वैकल्पिक उत्तेजना को कम करने की अनुमति देता है; v) एक प्रारूप है कि PIMS पायथन ^package26 द्वारा पढ़ा जा सकता है में दर्ज छवि अनुक्रम प्रति एक फ़ाइल का आउटपुट. विशेष रूप से, multipage TIFF फ़ाइलें समर्थित हैं।

Protocol

1. सॉफ़्टवेयर आवश्यकताएँ मिनीकोंडा पायथन वितरण 27 स्थापित करें (न्यूनतम आवश्यक पायथन संस्करण: 3.7)। Windows प्रारंभ मेनू में एक एनाकोंडा प्रॉम्प्ट खोलें, या एक टर्मिनल खोलें और लिनक्स या macOS का उपयोग करते समय कोंडा सक्रिय निष्पादित करें। निम्न आदेशों को निष्पादित करके समुदाय-बनाए रखा कोंडा-फोर्ज पैकेज रिपॉजिटरी28 सक्षम करें:कोंडा कॉन्फ़िग –चैनल जोड़ें कोंडा-फोर्जकोंडा config –सेट channel_priority सख्तकोंडा अद्यतन –सभी निष्पादित करके आवश्यक पायथन पैकेज स्थापित करें:कोंडा opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab स्थापित करें JupyterLab, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ परिचित हो जाओ (सॉफ़्टवेयर प्रलेखन 29 देखें)। गिट संस्करण नियंत्रण प्रणाली स्थापित करें, जिसका उपयोग बाद में विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को डाउनलोड और अपडेट करने के लिए किया जाएगा। यदि लिनक्स का उपयोग कर रहे हैं, तो डाउनलोड और अपडेट करने के लिए वितरण के पैकेज प्रबंधन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। अन्यथा, निष्पादित करें:कोंडा स्थापित गिट वैकल्पिक रूप से विश्लेषण के दौरान चरणों को फ़िल्टर करने के बाद डेटासेट प्रदर्शित करने के लिए साइडकार पायथन पैकेज स्थापित करें:कोंडा इंस्टाल साइडकार 2. नमूनों का मापन चित्रा 1: छवि अधिग्रहण. (ए) उत्तेजना अनुक्रम। 405 एनएम लेजर का उपयोग करके एक डाई-लोडेड सेल की एक वैकल्पिक छवि रिकॉर्ड करने के बाद, दाता और स्वीकर्ता क्रमशः 532 एनएम और 640 एनएम लेजर का उपयोग करके रोशनी समय टिल के लिए बारी-बारी से और बार-बार उत्साहित होते हैं। दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना के बीच का समय कैमरे द्वारा छवि रीडआउट के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त लंबा होना चाहिए। देरी समय tdelay अधिग्रहण फ्रेम दर को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए, photobleaching से पहले अवलोकन समय अवधि. इस पैनल को 16 से संशोधित किया गया है। (बी) दो उत्सर्जन चैनलों के बीच निर्देशांक रूपांतरण की गणना के लिए फिड्यूशियल मार्करों का उपयोग किया जाता है। मिलान fiducials रंग द्वारा इंगित कर रहे हैं. यह सुनिश्चित करने के लिए कई स्थानांतरित छवियों को रिकॉर्ड किया जाना चाहिए कि दृश्य का पूरा क्षेत्र कवर किया गया है। (सी) फ्लैटफील्ड सुधार के लिए लेजर प्रोफाइल एक घनी लेबल वाले नमूने का उपयोग करके दर्ज किए जाते हैं। स्वीकर्ता प्रोफ़ाइल रिकॉर्ड किया गया है और photobleached, दाता प्रोफ़ाइल के अधिग्रहण के बाद. कई छवियों को विभिन्न नमूना क्षेत्रों में लिया जाना चाहिए, नमूना अपूर्णताओं के प्रभाव को कम करने के लिए औसत, और चिकना किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, छवि के केंद्र-शीर्ष में उज्ज्वल स्थान)। (डी) फ्लैटफील्ड सुधार मानचित्र पी (एक्स, वाई) की गणना 20 लेजर प्रोफाइल से की जाती है जैसा कि सी में वर्णित है। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; IMDD = दाता उत्तेजना पर दाता उत्सर्जन छवि; ImDA = दाता उत्तेजना पर स्वीकर्ता उत्सर्जन छवि; IMAA = दाता उत्तेजना पर स्वीकर्ता उत्सर्जन छवि. स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें। इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरे का उपयोग करते समय, EM लाभ को उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात (निर्माता के निर्देशों को देखें) पर एकल-अणु संकेतों का निरीक्षण करने में सक्षम करें। उत्तेजना अनुक्रम (अधिक जानकारी के लिए चित्रा 1A देखें)। वैकल्पिक रूप से दृश्य के क्षेत्र में कुछ क्षेत्रों में डेटा विश्लेषण को प्रतिबंधित करने के लिए विभाजन के लिए एक छवि रिकॉर्ड करें। उदाहरण के लिए, 405 एनएम लेजर का उपयोग करके फुरा -2-लोड कोशिकाओं को उत्तेजित करें और कोशिकाओं और समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी) के बीच इंटरफेस में स्थित केवल जांच का मूल्यांकन करने के लिए 510 एनएम के आसपास उनके उत्सर्जन पर कब्जा करें। नतीजतन, कैमरा रीडआउट की अनुमति देने के लिए समय tr के लिए प्रतीक्षा करें।नोट:: EMCCD कैमरों पर, tr ब्याज (ROI) के चुने हुए क्षेत्र में लाइनों की संख्या पर निर्भर करता है। इसलिए, एक छोटा ROI चुनना फायदेमंद हो सकता है क्योंकि यह फ्रेम और रिकॉर्ड किए गए डेटा के आकार के बीच देरी को कम करता है। इसके अतिरिक्त, फ्रेम स्थानांतरण मोड को सक्षम करने से टीआर में और कमी आती है। वैकल्पिक रूप से दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस को बार-बार उत्तेजित करते हैं। एक रोशनी समय टिल के लिए दाता को उत्तेजित करें (5-10 एमएस आमतौर पर गति धुंधला से बचने के लिए पर्याप्त कम होता है) जबकि कैमरे को भी ट्रिगर करता है। कैमरा रीडआउट की अनुमति देने के लिए समय tr के लिए प्रतीक्षा करें। कैमरे को ट्रिगर करते समय स्वीकर्ता को उत्तेजित करें। एक समय tdelay के लिए प्रतीक्षा करें।नोट:: यह कैमरे द्वारा रीडआउट को सक्षम करने के लिए tr से अधिक लंबा होना चाहिए, लेकिन अन्यथा मनमाने ढंग से चुना जा सकता है। यह समय संकल्प और लंबाई का पता लगाने के लिए आवश्यकताओं को संतुलित करेगा। चरण 2.2.2.1-2.2.2.4 दोहराएँ। देखने के क्षेत्र के भीतर प्रति जांच कम से कम एक फ्लोरोफोर की फोटोब्लीचिंग सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ी होने के लिए पुनरावृत्ति की संख्या चुनें, जो समुच्चय से एकल-अणु संकेतों के भेदभाव के लिए चरणबद्ध फोटोब्लीचिंग विश्लेषण की अनुमति देता है।नोट: उपयुक्त टिल और उत्तेजना लेजर तीव्रता का चयन करने के लिए आमतौर पर कुछ प्रयोग की आवश्यकता होती है: रोशनी का समय जितना अधिक होता है और लेजर तीव्रता जितनी अधिक होती है, परिणामी छवियों में सिग्नल-टू-शोर अनुपात उतना ही बेहतर होता है, लेकिन परिणामस्वरूप समय के निशान जितने कम होते हैं। प्रत्येक नमूने के लिए फिल्मों की पर्याप्त संख्या रिकॉर्ड करें। 3. सुधार कारकों के निर्धारण के लिए अतिरिक्त माप छवि पंजीकरण के लिए दोनों उत्सर्जन चैनलों में दिखाई देने वाले बेतरतीब ढंग से रखे गए फिड्यूशियल मार्करों की एक श्रृंखला रिकॉर्ड करें (यानी, परिवर्तन ढूंढना जो दाता उत्सर्जन चैनल के निर्देशांक को स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल पर मैप करता है और इसके विपरीत)। चित्र 1B देखें।नोट:: छवि पंजीकरण सॉफ्टवेयर द्वारा किया जाता है; चरण 6.1.4 देखें। फ्लैटफील्ड सुधार के लिए दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना प्रकाश स्रोतों दोनों के लिए तीव्रता प्रोफ़ाइल को मापें (यानी, दृश्य के क्षेत्र में असमान उत्तेजना के लिए सही)। इस अंत के लिए, FRET जांच के एक उच्च घनत्व की विशेषता वाला एक नमूना तैयार करें और पहले स्वीकर्ता उत्तेजना पर एक छवि प्राप्त करें, इसके बाद स्वीकर्ता की फोटोब्लीचिंग और दाता उत्तेजना पर एक छवि की बाद की रिकॉर्डिंग। बढ़ी हुई स्थिरता के लिए, विभिन्न नमूना क्षेत्रों में कई बार दोहराएं। चित्र 1C, D देखें। वैकल्पिक रूप से, केवल दाता अणु के साथ सजाया गया एक नमूना रिकॉर्ड करें और केवल स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस के साथ सजाया गया एक दूसरा नमूना।नोट:: Flatfield सुधार विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा किया जाता है; चरण 8.1.2 देखें। स्वीकर्ता चैनल में लीक होने वाले दाता उत्सर्जन को निर्धारित करने के लिए एक स्वीकर्ता फ्लोरोफोर के बिना एक जांच का एक एकल-अणु नमूना (जैसा कि खंड 2 में) रिकॉर्ड करें।नोट: दाता रिसाव भी स्वीकर्ता ब्लीचिंग के बाद वास्तविक जांच के समय के निशान से गणना की जा सकती है। यदि ऐसी घटनाओं की पर्याप्त संख्या दर्ज की जाती है, तो कोई अतिरिक्त माप आवश्यक नहीं है। दोनों विकल्प विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा समर्थित हैं; अनुपूरक जानकारी, अनुभाग 3.15 देखें। दाता उत्तेजना प्रकाश स्रोत द्वारा प्रत्यक्ष स्वीकर्ता उत्तेजना के परिमाणीकरण के लिए एक दाता fluorophore के बिना एक जांच की रिकॉर्डिंग प्राप्त करें।नोट: प्रत्यक्ष स्वीकर्ता उत्तेजना भी दाता ब्लीचिंग के बाद वास्तविक जांच के समय के निशान से व्युत्पन्न किया जा सकता है। यदि ऐसी घटनाओं की पर्याप्त संख्या दर्ज की जाती है, तो कोई अतिरिक्त माप आवश्यक नहीं है। दोनों विकल्प विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा समर्थित हैं; अनुपूरक जानकारी, अनुभाग 3.15 देखें। दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनलों की अलग-अलग पहचान क्षमताओं और रंजक की अलग-अलग क्वांटम पैदावार के लिए सही करने के लिए दो अलग-अलग FRET क्षमताओं की विशेषता वाले एक एकल-अणु नमूने को रिकॉर्ड करें।नोट: इस तरह के नमूने हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, होलीडे जंक्शन1, जो दो संरचनाओं, या डीएनए छड़ों के बीच उतार-चढ़ाव करते हैं, जिनमें अलग-अलग, अच्छी तरह से परिभाषित दूरी पर फ्रेट जोड़े संलग्न होते हैं। यदि जांच में उच्च और पर्याप्त रूप से निरंतर FRET दक्षता होती है, तो सुधार की गणना स्वीकर्ता ब्लीचिंग घटनाओं से भी की जा सकती है, जो जांच के समय के निशान की घटनाओं को ब्लीच करती है, जिस स्थिति में कोई अतिरिक्त माप आवश्यक नहीं है। दोनों विकल्प विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा समर्थित हैं; अनुपूरक जानकारी, अनुभाग 3.15 देखें। 4. एकल अणु स्थानीयकरण एल्गोरिदम नोट:: कई विश्लेषण चरणों को एकल-अणु स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है। एक गाऊसी फिटिंग एल्गोरिथ्म 30 और केंद्र के द्रव्यमान गणना 31 के बीच चुनें, संकेत घनत्व, पृष्ठभूमि, और संकेत-से-शोर अनुपात पर निर्भर करता है। गाऊसी फिटिंग करने के लिए, संबंधित उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के माध्यम से 3D-DAOSTORM30 एल्गोरिथ्म चुनें।नोट: 3D-DAOSTORM ओवरलैपिंग बिंदु प्रसार कार्यों के साथ भी संकेतों को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि यह आम तौर पर एक लाभ है, यह एक चेतावनी के साथ आता है: एकल, उज्ज्वल संकेतों को कभी-कभी दो आसन्न लोगों के रूप में पहचाना जाता है, जो ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म को भ्रमित कर सकते हैं और परिणामस्वरूप एक लंबे के बजाय दो छोटे प्रक्षेपवक्रों का पता लगा सकते हैं।निम्न पैरामीटर सेट करें (विवरण के लिए, sdt-python library32 के प्रलेखन देखें, जो एल्गोरिथ्म के कार्यान्वयन को प्रदान करता है)। त्रिज्या: प्रभावी पिक्सेल आकार के आधार पर पिक्सेल में गाऊसी फ़िट फ़ंक्शन का प्रारंभिक σ मान सेट करें. थ्रेशोल्ड: एक स्थानीय तीव्रता अधिकतम फिट होने के लिए एक न्यूनतम आयाम (यानी, सबसे उज्ज्वल पिक्सेल मान, अनुमानित स्थानीय पृष्ठभूमि के लिए सही) सेट करें।नोट:: थ्रेशोल्ड यकीनन सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर है। यदि बहुत कम सेट किया जाता है, तो शोर को एक प्रतिदीप्ति संकेत माना जा सकता है, और उज्ज्वल संकेतों को दो गॉसियन के साथ फिट किया जा सकता है। यदि बहुत अधिक सेट किया गया है, तो मंद संकेत फिट नहीं हैं। मॉडल: परिपत्र गॉसियन फिट करने के लिए 2 डी करने के लिए सेट करें।नोट:: अन्य मॉडल smFRET डेटा के लिए लागू नहीं हैं। फ़िल्टर खोजें: शोर को कम करने के लिए स्थानीय मैक्सिमा को खोजने से पहले एक फ़िल्टर लागू करें, जो कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात स्थितियों में सहायक है। यह हो सकता है i) पहचान: कोई फ़िल्टर नहीं; ii) क्रॉकर-ग्रियर: क्रॉकर-ग्रियर एल्गोरिथ्म 31,33 से बैंडपास फ़िल्टर; या iii) गाऊसी: सिग्मा पैरामीटर द्वारा निर्धारित σ के साथ एक गाऊसी धुंधला।नोट:: Crocker-Grier के लिए, करतब. आकार पैरामीटर मोटे तौर पर पिक्सेल में एक बिंदु प्रसार समारोह की त्रिज्या होना चाहिए।नोट:: फिटिंग unfiltered कच्चे डेटा का उपयोग कर किया जाता है। min. दूरी: एक एकल गाऊसी द्वारा मिनट से कम दूरी पिक्सेल द्वारा अलग किए गए दो संभावित संकेतों को फिट करें।नोट:: यह जहाँ एक उज्ज्वल संकेत गलत तरीके से दो आसन्न संकेतों के रूप में पता लगाया जाता है aforementioned परिदृश्य में मदद कर सकते हैं। आकार सीमा: शोर के कारण नकली संकेतों से पता लगाने को हटाने के लिए फिट बैठता है की न्यूनतम और अधिकतम σ का चयन करें। केंद्र-के-द्रव्यमान गणना (क्रॉकर और ग्रियर के idea33 पर आधारित एक परिष्कृत एल्गोरिथ्म 31) करने के लिए संबंधित उपयोगकर्ता इंटरफेस के माध्यम से क्रॉकर-ग्रियर एल्गोरिथ्म चुनें।नोट: यह एल्गोरिथ्म कम सिग्नल-टू-शोर परिदृश्यों में भी बहुत मजबूत है और तीव्रता की एक श्रृंखला की विशेषता वाले संकेतों से निपटने में भी, लेकिन ओवरलैपिंग बिंदु प्रसार कार्यों के साथ अणुओं को ठीक से फिट नहीं कर सकता है। त्रिज्या: एक डिस्क की त्रिज्या (पिक्सेल में) सेट करें जो पूरे बिंदु स्प्रेड फ़ंक्शन को शामिल करने के लिए पर्याप्त बड़ी है। संकेत thresh.: एक स्थानीय तीव्रता अधिकतम विश्लेषण किया जा करने के लिए के लिए न्यूनतम आयाम (अनुमानित पृष्ठभूमि से ऊपर सबसे उज्ज्वल पिक्सेल) सेट करें।नोट:: यदि बहुत कम सेट है, तो शोर एक प्रतिदीप्ति संकेत माना जा सकता है। यदि बहुत अधिक सेट किया गया है, तो मंद संकेत फिट नहीं हैं। द्रव्यमान thresh.: विश्लेषण करने के लिए एक संकेत की न्यूनतम कुल तीव्रता (पृष्ठभूमि-सही पिक्सेल मानों का योग) सेट करें।नोट: ऊपर के रूप में एक ही विचार लागू होते हैं। 5. सॉफ्टवेयर प्रारंभ विश्लेषण स्क्रिप्ट डाउनलोड करें. एक एनाकोंडा प्रॉम्प्ट में, विश्लेषण को सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर पर नेविगेट करें ( cd आदेश का उपयोग करके) और निष्पादित करेंलक्ष्य फ़ोल्डर https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git गिट क्लोन लक्ष्य फ़ोल्डर को वर्णनात्मक नाम जैसे 2021-06-14_Force-FRET-प्रयोग से बदलें.नोट:: विश्लेषण सॉफ़्टवेयर इस फ़ोल्डर में समाप्त हो जाएगा; सुनिश्चित करें कि यह फ़ोल्डर पहले से मौजूद नहीं है। प्रत्येक प्रयोग के लिए विश्लेषण स्क्रिप्ट की एक प्रति डाउनलोड करने की सिफारिश की जाती है। इस तरह, बाद में विश्लेषण को फिर से देखना, उपयोग किए गए मापदंडों को याद करना और परिवर्तन करना संभव है। Jupyter नोटबुक्स की प्रतिलिपि बनाएँ (01. Tracking.ipynb, 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb) नव निर्मित फ़ोल्डर में (अब से रूट फ़ोल्डर के रूप में संदर्भित)। यदि यह सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने का पहली बार है, तो उन्हें रूट फ़ोल्डर के नोटबुक सबफ़ोल्डर से प्राप्त करें।नोट:: यदि समान डेटासेट का पहले से ही विश्लेषण किया जा चुका है, तो पिछले प्रयोग से नोटबुक की प्रतिलिपि बनाना एक सुविधाजनक विकल्प हो सकता है, क्योंकि पैरामीटर केवल थोड़ा बदल सकते हैं। JupyterLab सर्वर को Anaconda प्रॉम्प्ट में JupyterLab प्रदर्शित करने वाली वेब ब्राउज़र विंडो को खोलने के लिए निम्न आदेश निष्पादित करके प्रारंभ करें।जूपीटर लैबनोट:: ब्राउज़र केवल इंटरफ़ेस है, जबकि प्रक्रिया Anaconda प्रॉम्प्ट में चल रहा है वास्तविक कार्य कर रहा है। नतीजतन, ब्राउज़र विंडो को बंद करने का केवल न्यूनतम प्रभाव पड़ता है; सत्र को http://localhost:8888 तक पहुँचकर पुनर्स्थापित किया जा सकता है. हालांकि, प्रॉम्प्ट में JupyterLab प्रक्रिया को बाधित करना या प्रॉम्प्ट को बंद करना विश्लेषण को समाप्त कर देगा, जिससे न सहेजे गए कार्य का नुकसान होगा। JupyterLab ब्राउज़र विंडो में, रूट फ़ोल्डर पर नेविगेट करने के लिए बाएँ फलक का उपयोग करें। 01. Tracking.ipynb पर डबल-क्लिक करें पहली नोटबुक लॉन्च करने के लिए। लॉन्च करने के बाद, दिखाई देने के लिए एक नया टैब देखें, जो पायथन कोड के बक्से, तथाकथित कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है।नोट:: सभी Jupyter नोटबुक्स प्रत्येक कोड कक्ष की कार्यक्षमता का वर्णन टिप्पणियाँ सुविधा। साथ ही, प्रत्येक विधि कॉल के लिए दस्तावेज़ीकरण को खोलने से तुरंत पहले पाठ कर्सर रखकर प्रदर्शित किया जा सकता है ( और Shift+ Tab दबाएँ. डेटा विश्लेषण प्रक्रिया के अवलोकन के लिए चित्र 2 देखें. चित्रा 2: एक विशिष्ट विश्लेषण पाइपलाइन का अवलोकन। ध्यान दें कि फ़िल्टरिंग चरण प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार अनुकूलन के अधीन हैं। इस आंकड़े को 16 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. नोट:: सॉफ़्टवेयर को आज़माने के लिए नमूना डेटा https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files से डाउनलोड किया जा सकता है 6. स्थानीयकरण, ट्रैकिंग, और एकल अणुओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण (01). Tracking.ipynb)। का उपयोग करें 01. Tracking.ipynb एकल-अणु संकेतों के प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के विश्वसनीय विश्लेषण के लिए जुपिटर नोटबुक, जो सटीक परिमाणीकरण के लिए तैयार किया गया है, विशेष रूप से बेहोश संकेतों के अक्सर FRET माप में होते हैं (उदाहरण के लिए, उच्च FRET घटनाओं पर कम दाता संकेतों के कारण और इसके विपरीत)।नोट:: इस अंत के लिए, स्थानीय पृष्ठभूमि के लिए सुधार के साथ कच्चे डेटा में पिक्सेल तीव्रता का प्रत्यक्ष एकीकरण लागू किया गया है। प्रत्येक विश्लेषण चरण के स्क्रीनशॉट और फ़ंक्शन कॉल पैरामीटर के विवरण के लिए, देखें पूरक जानकारी.दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना फ्रेम के चयन की अनुमति देने के लिए रोशनी अनुक्रम निर्दिष्ट करें, साथ ही रिकॉर्ड किए गए छवि अनुक्रमों से छवि विभाजन के लिए फ्रेम भी।नोट: जैसा कि सॉफ़्टवेयर मनमाने ढंग से रोशनी प्रोटोकॉल के साथ रिकॉर्ड किए गए डेटा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है, यह इंगित करना आवश्यक है कि छवि अनुक्रम में कौन सा फ्रेम प्राप्त किया गया था, जबकि रोमांचक किस प्रकार के फ्लोरोफोर; अनुपूरक जानकारी, अनुभाग 1.2, चरण 3 देखें। मूल छवि अनुक्रम के फ़्रेम नंबर संरक्षित हैं। डेटासेट का वर्णन करें और लोड करें. एक ही बार में कई डेटासेट का विश्लेषण करें, बशर्ते कि वे एक ही रोशनी सेटिंग्स का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए हों। एक पहचानकर्ता और एक पैटर्न असाइन करें जो प्रत्येक डेटासेट के लिए संबंधित छवि अनुक्रम फ़ाइल नामों से मेल खाता है। इसके अतिरिक्त, विशेष उद्देश्यों के लिए विशिष्ट डेटासेट को परिभाषित करें, जैसे कि छवि पंजीकरण के लिए फिड्यूशियल मार्करों की रिकॉर्डिंग, फ्लैटफील्ड सुधार के लिए उत्तेजना प्रकाश प्रोफाइल, और वैकल्पिक रूप से सुधार कारकों को निर्धारित करने के लिए केवल दाता और स्वीकर्ता-केवल नमूने। कच्चे चित्रों में उत्सर्जन चैनलों का चयन करें यदि दोनों चैनलों को एक ही कैमरे का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। इसके लिए, दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन के लिए उपयुक्त क्षेत्रों का चयन करने के लिए उपयुक्त ग्राफिकल विजेट का उपयोग करें। दोनों उत्सर्जन चैनलों में fiducial मार्करों स्थानीयकरण और छवि पंजीकरण प्रदर्शन. दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनलों दोनों के लिए स्थानीयकरण एल्गोरिथ्म के लिए उपयुक्त पैरामीटर खोजने के लिए प्रदान किए गए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का उपयोग करें। समर्थित स्थानीयकरण एल्गोरिदम के बारे में जानकारी के लिए अनुभाग 4 देखें.नोट: बेतरतीब ढंग से वितरित fiducial मार्करों उत्सर्जन चैनलों में उनके निकटतम पड़ोसियों के स्थानिक वितरण द्वारा पहचाना जा सकता है (चित्रा 1B). एसडीटी-पायथन लाइब्रेरी में चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी 34 के लिए प्रस्तावित एल्गोरिथ्म का एक कस्टम कार्यान्वयन स्वचालित रूप से स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल में स्थिति के साथ दाता उत्सर्जन चैनल में प्रत्येक मार्कर की स्थिति से मेल खाता है। स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल के निर्देशांक के लिए दाता उत्सर्जन चैनल के निर्देशांक को मैप करने वाला एक परिवर्तन टी मार्करों की स्थिति 35 के लिए एक affine परिवर्तन के रैखिक कम से कम वर्गों फिट के माध्यम से पाया जाता है। RANSAC का उपयोग बाहरी लोगों के लिए खाते के लिए किया जाता है, जैसे कि पिछले चरण से गलत तरीके से मिलान की गई स्थिति। सभी फ़्रेमों में दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना पर FRET जांच को स्थानीयकृत करें और परिणामों को एक तालिका में मर्ज करें जिसमें मूल फ़्रेम संख्या, 2-आयामी निर्देशांक और स्रोत छवि फ़ाइल का उल्लेख करने वाला एक पहचानकर्ता होता है.नोट:: इस अंत के लिए, सॉफ़्टवेयर स्थानीयकरण एल्गोरिथ्म के लिए उपयुक्त विकल्प ढूँढने के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्रदान करता है। दाता उत्सर्जन ImDD और स्वीकर्ता उत्सर्जन ImDA, जो शायद ही FRET दक्षता पर निर्भर से प्राप्त छवियों के योग में दाता उत्तेजना पर FRET जांच स्थानीयकरण. स्थानीयकरण एल्गोरिथ्म के लिए विकल्पों से संबंधित जानकारी के लिए, अनुभाग 4 देखें.नोट:: प्रत्येक योग छवि पहले छवि पंजीकरण से प्राप्त परिवर्तन T का उपयोग कर ImDD को परिवर्तित करके परिकलित किया जाता है और ImDA करने के लिए पिक्सेलवाइज जोड़ा जाता है। स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल ImAA में स्वीकर्ता उत्तेजना पर जांच को स्थानीयकृत करें (स्थानीयकरण एल्गोरिदम के बारे में विवरण के लिए अनुभाग 4 देखें)। ट्रैकिंग और प्रतिदीप्ति तीव्रता मापन करें। चित्रा 3: एकल-अणु तीव्रता माप। (ए) नारंगी पिक्सेल पर स्थित एक फ्लोरोफोर के लिए, इसकी असंशोधित तीव्रता Iuncorr एक डिस्क (पीले और नारंगी पिक्सेल) के भीतर सभी पिक्सेल की तीव्रता को संक्षेप में प्रस्तुत करके निर्धारित की जाती है जो सिग्नल से प्रभावित सभी पिक्सेल को कवर करने के लिए पर्याप्त है: । स्थानीय पृष्ठभूमि की गणना डिस्क के चारों ओर एक अंगूठी (नीले पिक्सेल) में पिक्सेल के माध्य के रूप में की जाती है: , जहां रिंग में पिक्सेल की संख्या है। प्रतिदीप्ति तीव्रता मैं uncorrected तीव्रता से पृष्ठभूमि घटाने का परिणाम है, मैं = Iuncorr – b × ndisk, जहां ndisk डिस्क में पिक्सेल की संख्या है. सर्कल त्रिज्या ट्रैकिंग विधि के feat_radius पैरामीटर के माध्यम से निर्दिष्ट किया गया है। अंगूठी की चौड़ाई bg_frame पैरामीटर द्वारा दी गई है। यदि एक सिग्नल का बिंदु प्रसार फ़ंक्शन दूसरे (निचले पैनल) की पृष्ठभूमि की अंगूठी के साथ ओवरलैप होता है, तो प्रभावित पिक्सेल (लाल) को स्थानीय पृष्ठभूमि विश्लेषण से बाहर रखा जाता है। यदि दो बिंदु प्रसार फ़ंक्शन ओवरलैप होते हैं, तो प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना मज़बूती से नहीं की जा सकती है और इसलिए उन्हें छोड़ दिया जाता है। (B, C) सिमुलेशन से पता चलता है कि 1 पिक्सेल के मानक विचलन के साथ एक गाऊसी धुंधला लागू करने से सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार होता है जो कम प्रतिदीप्ति तीव्रता (बी) पर 2 के करीब के कारक तक होता है और शायद ही किसी भी त्रुटि का परिचय देता है (1% से कम, (सी)) 16 से कम। इसके अलावा, सापेक्ष त्रुटि (यानी, (Imeas – Itruth)/Itruth, जहां Itruth जमीनी सच्चाई है और Imeas विश्लेषण का परिणाम है) पूरी तीव्रता सीमा पर स्थिर है और इसलिए FRET दक्षता और stoichiometries जैसे ratiometric मात्रा के लिए रद्द कर देता है। सभी भूखंड पहले प्रकाशित work16 पर आधारित हैं। संक्षिप्त रूप: एसएनआर = सिग्नल-टू-शोर अनुपात; FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. Trackpy36algorithm के लिए उपयुक्त विकल्प चुनें जो FRET जांच स्थानीयकरणों को प्रक्षेपवक्र में लिंक करने के लिए उपयोग किया जाता है। विशेष रूप से, एक फ्रेम से अगले तक अधिकतम खोज दूरी और लगातार फ्रेम की संख्या निर्धारित करें जिसके लिए एक संकेत अज्ञात हो सकता है, जो ब्लीचिंग या मिस्ड स्थानीयकरण के कारण हो सकता है।नोट:: इन अंतरालों को पूर्ववर्ती और आगामी पदों के बीच इंटरपोलेशन के माध्यम से भरा जाता है। इन इंटरपोलेटेड पदों को चिह्नित किया जाता है और केवल बाद में तीव्रता मूल्यों को पढ़ने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन प्रसार विश्लेषण के लिए नहीं। पटरियों का विश्लेषण स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनल की समन्वय प्रणाली में किया जाता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण (चरण 6.1.6.2) के लिए, पटरियों को अतिरिक्त रूप से छवि पंजीकरण के माध्यम से प्राप्त व्युत्क्रम परिवर्तन टी -1 का उपयोग करके दाता उत्सर्जन चैनल की समन्वय प्रणाली में परिवर्तित किया जाता है (चरण 6.1.4 देखें)। प्रतिदीप्ति तीव्रता परिकलन एल्गोरिथ्म के लिए विकल्पों का चयन करें (विवरण के लिए चित्र 3A देखें). i) एक डिस्क की त्रिज्या निर्दिष्ट करें, जो किसी सिग्नल की स्थिति पर केंद्रित होने पर, उस सिग्नल से प्रभावित सभी पिक्सेल और ii) स्थानीय पृष्ठभूमि निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक डिस्क के चारों ओर एक अंगूठी की चौड़ाई होती है।नोट: प्राप्त तीव्रता माप में शोर को कम करने के लिए, 1 पिक्सेल के मानक विचलन के साथ एक गाऊसी धुंधला छवियों (चित्रा 3B, C) पर लागू किया जाता है। छवि अनुक्रमों से सहायक छवि डेटा को संसाधित करने के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर कार्यक्षमता का उपयोग करें. विभाजन को सुविधाजनक बनाने के लिए रिकॉर्ड की गई अतिरिक्त छवियों को निकालें (चरण 2.2.1 देखें, उत्तेजना अनुक्रम में s द्वारा चिह्नित ( पूरक जानकारी, अनुभाग 1.2, चरण 3 देखें)। एक घनी लेबल वाले नमूने पर दर्ज छवियों से दृश्य के क्षेत्र में दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना प्रकाश प्रोफाइल निर्धारित करें (चरण 3.2 देखें)।नोट:: पिक्सेल-दर-पिक्सेल माध्य प्रकाश प्रोफ़ाइल की गणना करने के लिए छवियों से परिकलित किया जाता है। कैमरा बेसलाइन घटाया जाता है। नमूना अशुद्धियों के कारण प्रभाव को कम करने के लिए एक गाऊसी फ़िल्टर का उपयोग करके छवियों को धुंधला कर दिया जाता है। अंत में, परिणामी छवियों को उनके अधिकतम मूल्य से पिक्सेलवाइज विभाजित किया जाता है ताकि प्रोफ़ाइल p(x,y) अंतराल [0,1] पर निर्देशांक मानचित्रण प्राप्त किया जा सके। 7. FRET trajectories के विज़ुअलाइज़ेशन (वैकल्पिक) कच्चे छवि डेटा और इसी प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्पष्ट FRET दक्षता और stoichiometries में एकल अणु पटरियों को प्रदर्शित करने के लिए निरीक्षक आवेदन का उपयोग करें।नोट:: यह चुने गए पैरामीटर की वैधता का आकलन करने और मैन्युअल रूप से स्वीकार करने या व्यक्तिगत समय ट्रेस अस्वीकार करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। स्क्रीनशॉट और विस्तृत उपयोग जानकारी के लिए पूरक जानकारी देखें. 8. विश्लेषण और एकल अणु डेटा के फ़िल्टरिंग (02. Analysis.ipynb) का उपयोग करें 02. Analysis.ipynb Jupyter विश्लेषण और एकल अणु डेटा के फ़िल्टरिंग के माध्यम से प्राप्त के लिए नोटबुक 01. Tracking.ipynb नोटबुक। एक विशिष्ट विश्लेषण पाइपलाइन के लिए नीचे दिए गए चरणों को देखें।नोट: विभिन्न वैज्ञानिक प्रश्नों और प्रयोगात्मक डिजाइनों को सेटिंग्स के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। Jupyter नोटबुक का उपयोग विश्लेषण चरणों को छोड़ने, पुनर्व्यवस्थित करने और संशोधित करके आसान अनुकूलन की अनुमति देता है। प्रत्येक विश्लेषण चरण के स्क्रीनशॉट और फ़ंक्शन कॉल पैरामीटर के विवरण के लिए, देखें पूरक जानकारी.प्रारंभिक फ़िल्टरिंग चरण निष्पादित करें. ओवरलैपिंग बिंदु प्रसार कार्यों के साथ संकेतों को छोड़ दें क्योंकि उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को मज़बूती से निर्धारित करना मुश्किल है। असमान रोशनी के मामले में, केवल एक अच्छा संकेत-से-शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए दृश्य के क्षेत्र के भीतर अच्छी तरह से प्रबुद्ध क्षेत्रों में स्थित संकेतों को स्वीकार करें। यदि इंट्रामॉलिक्युलर FRET का अध्ययन कर रहे हैं, तो विश्लेषण को छवि अनुक्रम की शुरुआत से मौजूद उन प्रक्षेपवक्रों तक सीमित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी ब्लीचिंग चरणों को रिकॉर्ड किया गया है और बाद में चरणबद्ध फोटोब्लीचिंग विश्लेषण के दौरान ठीक से मूल्यांकन किया जा सकता है।नोट: जब इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट जांच के साथ प्रयोग करते हैं, जिसमें दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस एक पूर्वनिर्मित परिसर का हिस्सा नहीं होते हैं, तो विश्लेषण को शुरू में प्रस्तुत प्रक्षेपवक्र तक सीमित करना संभव नहीं हो सकता है। Flatfield सुधार निष्पादित करें, जो चरण 6.1.7.2 में प्राप्त उत्तेजना प्रकाश स्रोत प्रोफाइल का उपयोग करता है ताकि असमान रोशनी के कारण स्थिति-निर्भर प्रतिदीप्ति तीव्रता भिन्नताओं को उलट दिया जा सके।नोट: स्थिति (x, y) पर एक जांच की प्रतिदीप्ति तीव्रता I (x, y) के माध्यम से सही किया जाता है; चित्र 1C, D देखें। स्पष्ट FRET दक्षता Eapp की गणना करें (यानी, दाता fluorophore से स्वीकर्ता fluorophore करने के लिए प्रेषित ऊर्जा का अंश) और स्पष्ट stoichiometry सैप (यानी, दाता fluorophores की संख्या एक विवर्तन-सीमित स्थान के भीतर fluorophores की कुल संख्या से विभाजित).नोट: प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए E बनाम S प्लॉटिंग करके, stoichiometry18 में परिवर्तन के कारण परिवर्तन से दाता-स्वीकर्ता दूरी में परिवर्तन के कारण मापा FRET दक्षता में परिवर्तन को अलग करना संभव है। यह एक सक्रिय स्वीकर्ता की अनुपस्थिति के कारण ई = 0 से डाई अलगाव के कारण ई = 0 के बीच अंतर की अनुमति देता है। गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक उपकरण के रूप में विश्लेषण के दौरान ई-एस भूखंडों का उपयोग किया जाता है; एक उदाहरण के रूप में चित्र 4 देखें। एकल-आणविक जांच और समुच्चय के बीच भेदभाव के लिए फोटोब्लीचिंग का चरणबद्ध विश्लेषण करें। निम्न विकल्पों में से किसी एक को स्वीकार करने के लिए चुनें।नोट:: इस अंत के लिए, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर एक कस्टम implementation32 changepoint डिटेक्शन एल्गोरिथ्म PELT37 के अलग से दाता उत्तेजना (IDD + IDA) और स्वीकर्ता उत्तेजना (IAA) पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए लागू होता है। विकल्प 1 चुनें, जिसमें स्वीकर्ता फ्लोरोफोर एक ही चरण में ब्लीच करता है जबकि दाता कोई आंशिक ब्लीचिंग नहीं दिखाता है (यानी, गैर-शून्य तीव्रता के लिए कोई ब्लीचिंग कदम नहीं है)।नोट:: यह विकल्प आगे trajectories जहाँ दाता एक ही चरण में स्वीकर्ता से पहले bleaches अस्वीकार करता है। विकल्प 1 उच्च स्वीकर्ता photobleaching दरों के मामले में पसंदीदा विकल्प है। विकल्प 2 चुनें, जिसमें दाता एक ही चरण में ब्लीच करता है जबकि कोई आंशिक स्वीकर्ता ब्लीचिंग नहीं है।नोट:: यह विकल्प आगे trajectories जहाँ दाता एक ही चरण में स्वीकर्ता के बाद bleaches अस्वीकार करता है। विकल्प 2 उच्च दाता photobleaching दरों के मामले में पसंदीदा विकल्प है। विकल्प 3 चुनें, जिसमें या तो फ्लोरोफोर एक ही चरण में ब्लीच होता है जबकि दूसरा आंशिक रूप से ब्लीच नहीं करता है।नोट: विकल्प 3 विकल्प 1 और 2 की तुलना में उच्च लचीलापन देता है और डेटा विश्लेषण के लिए सुझाई गई वरीयता होगी। विकल्प 4 चुनें, जिसमें दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस एकल-चरण फोटोब्लीचिंग या कोई फोटोब्लीचिंग नहीं दिखाते हैं।नोट: विकल्प 4 कम photobleaching दरों के मामले में पसंद किया जाता है। स्वीकर्ता चैनल α में दाता उत्सर्जन रिसाव के लिए सुधार कारकों की गणना करें, प्रत्यक्ष स्वीकर्ता उत्तेजना δ, γ पता लगाने की क्षमता, और उत्तेजना क्षमता β 17। स्पष्ट दक्षता Eapp और स्पष्ट stoichiometry Sapp से FRET दक्षता ई की गणना करने के लिए सुधार कारकों का उपयोग करें। आगे फ़िल्टरिंग चरण निष्पादित करें। प्रत्येक प्रक्षेपवक्र में पहले ब्लीचिंग ईवेंट से पहले से केवल डेटा बिंदुओं का चयन करें। इसके अतिरिक्त, विश्लेषण को एकल-अणु जांच तक सीमित करने के लिए 0.35 < एस < 0.6 < संतुष्ट करने वाले कम से कम 75% डेटा बिंदुओं के साथ केवल प्रक्षेपवक्र स्वीकार करें (संख्याएं समायोज्य हैं)।नोट: के लिए ऊपरी और निचले सीमाओं को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, दाता-केवल और स्वीकर्ता-केवल आबादी) से बाहर किए जाने के लिए आबादी बनाम ब्याज की आबादी के प्रसार के अनुसार चुना जाना चाहिए। अनुभव के आधार पर, 0.35 < एस < 0.6 कई प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए एक अच्छा विकल्प साबित हुआ। विश्लेषण को दृश्य के क्षेत्र के भीतर अलग-अलग क्षेत्रों तक सीमित करने के लिए उपयुक्त सहायक छवियों (चरण 2.2.1 और 6.1.7 देखें) पर वैश्विक या अनुकूली थ्रेशोल्डिंग विधियों 35 के माध्यम से छवि विभाजन निष्पादित करें।नोट:: यह अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, एक सेल-SLB इंटरफ़ेस में स्थित जांच के अनन्य मूल्यांकन या एक patterned संरचना पर। 9. परिणामों की साजिश और आगे के विश्लेषण (03. Plot.ipynb) नोट:: Jupyter नोटबुक के स्क्रीनशॉट और फ़ंक्शन कॉल पैरामीटर का विवरण के लिए पूरक जानकारी देखें। यह सत्यापित करने के लिए ई-एस प्लॉट बनाएँ कि गलत स्टोइकोइमेट्री के संकेतों को सही ढंग से पहचाना गया है और हटा दिया गया है। FRET दक्षता वितरण का एक अच्छी तरह से स्थापित सिंहावलोकन प्रदान करने के लिए FRET दक्षता के प्लॉट हिस्टोग्राम। विभिन्न प्रयोगों से परिणामों की सुविधाजनक तुलना के लिए हिस्टोग्राम को समूहीकृत करें। डेटा का मूल्यांकन करें (उदाहरण के लिए, प्रसार विश्लेषण, वैज्ञानिक पायथन पुस्तकालयों का लाभ उठाते हुए नोटबुक के भीतर आणविक बल सेंसर या संक्रमण विश्लेषण का उपयोग करके प्रयोगों में बलों के लिए FRET दक्षता का रूपांतरण)।नोट:: डेटा भी अन्य विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के लिए इनपुट के रूप में कई फ़ाइल स्वरूपों में निर्यात किया जा सकता है।

Representative Results

प्रयोग के वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर smFRET पटरियों से विभिन्न प्रकार की निम्न और उच्च-स्तरीय जानकारी निकाली जा सकती है। यहां, एनालॉग और डिजिटल जांच के साथ विश्लेषण पाइपलाइनों के उदाहरण प्रस्तुत किए गए हैं: एक पेप्टाइड-आधारित आणविक बल सेंसर 16 और क्रमशः इसकी संरचना 38 के स्टोकेस्टिक स्विचिंग के साथ एक डीएनए जांच। इन जांचों के डिजाइन और कार्य सिद्धांत के लिए चित्रा 5 देखें। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में स्थानीयकरण और ट्रैकिंग एल्गोरिदम निष्पादित किए जाने के बाद, पैकेज प्रारंभिक मापदंडों और बाद के फ़िल्टर चरणों को अनुकूलित करने के लिए कई डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूल प्रदान करता है: (i) व्यक्तिगत smFRET घटनाओं का विज़ुअलाइज़ेशन, (ii) हितों के कुछ क्षेत्रों में डेटा का विश्लेषण करने के लिए वैकल्पिक छवि विभाजन, (iii) FRET दक्षता बनाम स्टोइकोइमेट्री (ई-एस) भूखंडों के माध्यम से फ़िल्टर चरणों की निगरानी। एकल-अणु डेटा का विज़ुअलाइज़ेशन चित्र 6 में प्रस्तुत किया गया है। अंत में, फ़िल्टर किए गए FRET ईवेंट को एक E-S प्लॉट और एक FRET दक्षता हिस्टोग्राम (चित्रा 4) द्वारा दर्शाया जाता है। ई-एस प्लॉट उपर्युक्त फ़िल्टरिंग चरणों को अनुकूलित करने और अंतिम परिणाम की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। आंशिक रूप से ब्लीच किए गए या अपूर्ण रूप से लेबल किए गए FRET सेंसर को उनके स्टोइकोमेट्री मूल्य द्वारा बाहर रखा जा सकता है। गतिशीलता पैरामीटर की जांच एक एक्स-वाई प्लॉट (चित्रा 6) या एक माध्य वर्ग विस्थापन (एमएसडी) प्लॉट (चित्रा 4) में एक व्यक्तिगत प्रक्षेपवक्र पथ की साजिश करके की जा सकती है। पहली विधि विशेष रूप से immobilized घटनाओं से मोबाइल भेदभाव के लिए उपयोगी है, जबकि उत्तरार्द्ध प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। चित्रा 4: अनुकरणीय आउटपुट. (ए) FRET दक्षता को आणविक बल सेंसर (बाएं पैनल) की आबादी के लिए स्टोइकोमेट्री (ई-एस प्लॉट) बनाम प्लॉट किया जाता है जो एक ग्लास-समर्थित लिपिड बाईलेयर को सजाता है और एक टी सेल द्वारा तनावपूर्ण होता है। केवल एक जनसंख्या बादल दिखाई दे रहा है। FRET दक्षताओं का संबंधित हिस्टोग्राम कोशिकाओं (मध्य पैनल) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में एक बल सेंसर आबादी के बीच के अंतर का उदाहरण देता है। टी कोशिकाओं की उपस्थिति में सेंसर आबादी की कम FRET दक्षताओं के लिए कोई बदलाव नहीं देखा जा सकता है, सेंसर मॉड्यूल के कोई बल-निर्भर खिंचाव के लिए बहुत कम संकेत देता है। इन प्रयोगात्मक स्थितियों का एमएसडी प्लॉट इस बात की पुष्टि करता है कि टी सेल के नीचे बल सेंसर आबादी उनके अनबाउंड समकक्षों (दाएं पैनल) की तुलना में काफी धीमी गति से चलती है। (बी) एक ही विश्लेषण Holliday जंक्शन डीएनए सेंसर के साथ एक ग्लास समर्थित तरल पदार्थ लिपिड बाईलेयर सजाने के साथ किया गया था। ई-एस प्लॉट स्पष्ट रूप से दो आबादी को दिखाता है, जो FRET दक्षता हिस्टोग्राम में भी स्पष्ट हैं। एमएसडी प्लॉट एक तेजी से आगे बढ़ने वाली सेंसर आबादी की उपस्थिति को इंगित करता है। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; MSD = मतलब वर्ग विस्थापन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 5: इंट्रामॉलिक्युलर FRET जांच का डिजाइन और काम करने का सिद्धांत( A) यांत्रिक आणविक बलों के परिमाणीकरण के लिए एनालॉग पेप्टाइड सेंसर। दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरस पेप्टाइड बैकबोन के दोनों छोर से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। सेंसर मॉड्यूल साइट-विशेष रूप से एक विशिष्ट लिगैंड से जुड़ा हुआ है, जो बदले में ब्याज के एक सेल-निवासी सतह रिसेप्टर को बांधता है (यहां, एक एंटीबॉडी टुकड़ा विशेष रूप से टी सेल रिसेप्टर की बीटा श्रृंखला को पहचानता है)। रिसेप्टर-लिगैंड बाइंडिंग पर, बल लगाया जाता है, और सेंसर मॉड्यूल फैलता है और अंततः बॉन्ड क्लीवेज के बाद पीछे हट जाता है। इस पैनल को 16 से संशोधित किया गया है। (बी) फ्रेट संक्रमणों के परिमाणीकरण के लिए डिजिटल डीएनए सेंसर। FRET सेंसर चार डीएनए किस्में एक Holliday जंक्शन बनाने से बना है. दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोर सहसंयोजक रूप से दो किस्में से जुड़े होते हैं। Holliday जंक्शनों अक्सर आसपास के बफर स्थितियों के आधार पर अपनी संरचना स्विच. इन संरचनाओं के स्टोकेस्टिक स्विचिंग की निगरानी व्यक्तिगत जांच की FRET दक्षता को परिमाणित करके की जा सकती है। संक्षिप्त रूप: TCR = T सेल रिसेप्टर; FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 6: स्थानीयकरण और FRET जांच की ट्रैकिंग के उदाहरण. (ए) व्यक्तिगत घटनाओं की FRET दक्षता और स्टोइकोइमेट्री की गणना दाता उत्तेजना (डी → डी), दाता उत्तेजना (डी → ए) पर स्वीकर्ता फ्लोरोफोर और स्वीकर्ता उत्तेजना (ए → ए) पर स्वीकर्ता फ्लोरोफोर की तीव्रता को निर्धारित करके की जाती है। निकटतम पड़ोसी फ़िल्टरिंग बंद emitters के अतिव्यापी बिंदु प्रसार कार्यों द्वारा पूर्वाग्रह को रोकता है। छवि विभाजन उपयोगकर्ता को ब्याज के क्षेत्र के भीतर स्थानीयकृत कुछ smFRET घटनाओं को चुनने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, एक सेल या एक माइक्रोपैटर्न)। छवि विभाजन के एक उदाहरण के रूप में, टी कोशिकाओं को फुरा -2 (बाईं ओर प्रदर्शित) के साथ दाग दिया गया था और सेल किनारों (नारंगी बिंदीदार रेखा) की पहचान करने के लिए अनुकूली थ्रेशोल्डिंग के अधीन किया गया था। स्केल सलाखों = 5 μm. (बी) smFRET trajectories आणविक बल सेंसर का उपयोग कर. अलग-अलग प्रक्षेपवक्रों को एक्स-वाई विमान में प्लॉट किया जा सकता है, उनके प्रसार व्यवहार और स्थानीयकरण (बाएं पैनल) की कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, प्रत्येक प्रक्षेपवक्र की तीव्रता को समय के साथ फ्रेट संक्रमण या ब्लीचिंग चरणों की पहचान करने के लिए प्लॉट किया जा सकता है (मध्य पैनल बाएं पैनल से लाल प्रक्षेपवक्र दिखाता है)। परिणामी FRET दक्षता और stoichiometry इसी तरह (सही पैनल) कल्पना की जा सकती है। (सी) होलिडे जंक्शन डीएनए सेंसर का उपयोग करके smFRET trajectories। HBSS + 12 mM MgCl2 का उपयोग माप के दौरान एक बफर के रूप में किया गया था। इन उदाहरणों के अनुक्रम अंत के पास स्पष्ट स्वीकर्ता ब्लीचिंग चरण के अलावा, प्रत्येक सेंसर के लिए FRET संक्रमण की आवृत्ति निर्धारित की जा सकती है। Holliday जंक्शनएक उच्च आवृत्ति के साथ अपनी संरचना स्विच, जबकि आणविक बल सेंसर FRET संक्रमण प्रदर्शित नहीं करता है. यह जानकारी प्रयोगात्मक स्थितियों को समायोजित करना संभव बनाती है, जैसे कि फ्रेम के बीच देरी, मनाया संक्रमण की संख्या को बढ़ाने या कम करने के लिए। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; smFRET = एकल अणु FRET; HBSS = हांक का संतुलित नमक समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. पूरक जानकारी: एकल अणुओं का स्थानीयकरण और ट्रैकिंग (01). Tracking.ipynb). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

यह लेख स्वचालित रिकॉर्डिंग और smFRET डेटा के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन का विवरण देता है जो मोबाइल अभी तक सतह-टेदर जांच अणुओं से उत्पन्न होता है। यह smFRET प्रयोगों के लिए दो प्रमुख दृष्टिकोणों को पूरक करता है, जिसमें या तो सतह-स्थिर जांच या एक confocal उत्तेजना वॉल्यूम ¹⁷ के अंदर और बाहर समाधान में diffusing जांच शामिल है। यह सही FRET दक्षता और समय के एक समारोह के रूप में आणविक पदों प्रदान करता है. इसलिए इसका उपयोग विशेष विश्लेषण कार्यक्रमों के लिए इनपुट के रूप में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संक्रमण कैनेटीक्स ¹, FRET हिस्टोग्राम ³⁹, या दो-आयामी प्रसार ²² को मापने के लिए।

सॉफ्टवेयर को ओपन सोर्स इनिशिएटिव द्वारा अनुमोदित एक मुक्त और ओपन-सोर्स लाइसेंस के तहत जारी किया गया है जो उपयोगकर्ता को मुफ्त उपयोग, संशोधन और पुनर्वितरण का निरंतर अधिकार प्रदान करता है। गिथब को एक विकास और वितरण मंच के रूप में चुना गया था ताकि सॉफ़्टवेयर प्राप्त करने और बग की रिपोर्टिंग या ^code40 का योगदान करके विकास प्रक्रिया में भाग लेने के लिए जितना संभव हो सके उतना आसान हो सके। पायथन में लिखा गया, सॉफ़्टवेयर मालिकाना घटकों पर निर्भर नहीं करता है। उपयोगकर्ता इंटरफेस के रूप में Jupyter नोटबुक की पसंद हर विश्लेषण चरण में डेटा के निरीक्षण की सुविधा प्रदान करता है और हाथ में प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए विशेष रूप से पाइपलाइन को सिलाई और विस्तारित करने की अनुमति देता है। एसडीटी-पायथन लाइब्रेरी ³² नींव के रूप में कार्य करता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डेटा का मूल्यांकन करने के लिए कार्यक्षमता को लागू करता है, जैसे कि एकल-अणु स्थानीयकरण, प्रसार विश्लेषण, प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण, रंग चैनल पंजीकरण, सहस्थानीयकरण विश्लेषण और आरओआई हैंडलिंग।

सिद्धांत रूप में, एकल-कण ट्रैकिंग को एक-, दो- या तीन-आयामी प्रणालियों में किया जा सकता है। यहां, एकल-अणु विश्लेषण पाइपलाइन को 2 डी मोबाइल सिस्टम के अध्ययन के अनुरूप बनाया गया था। यह विकल्प मोबाइल फ्लोरोसेंट जांच पेश करने के लिए सरल प्रणालियों की उपलब्धता को प्रतिबिंबित करता है, जैसे कि प्लानर-समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी)। इस तरह के लिपिड बाईलेयर सिस्टम आमतौर पर दो या दो से अधिक फॉस्फोलिपिड्स moieties से बने होते हैं, जहां थोक अंश एसएलबी (जैसे चरण और चिपचिपाहट) के प्रमुख भौतिक-रासायनिक मापदंडों को निर्धारित करता है, और मामूली अंश बायोमोलेक्यूल्स के लिए अनुलग्नक साइटें प्रदान करता है। इन अनुलग्नक साइटों को एविडिन के लिए बायोटिनिलेटेड फॉस्फोलिपिड्स- या स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित प्रोटीन प्लेटफार्मों या हिस्टिडीन टैग ⁴¹ के साथ प्रोटीन प्लेटफार्मों के लिए निकल-एनटीए संयुग्मित फॉस्फोलिपिड्स हो सकते हैं। एसएलबी के लिए प्रोटीन को जोड़ने के लिए उपयुक्त मंच का विकल्प वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करता है। पाठक सफलतापूर्वक नियोजित रणनीतियों के उदाहरणों के लिए साहित्य ^16,38,42 का उल्लेख कर सकते हैं। ओवरलैपिंग बिंदु प्रसार कार्यों से बचने के लिए नमूने में जांच का घनत्व पर्याप्त रूप से कम होना चाहिए; आमतौर पर, प्रति ^μm2 0.1 अणुओं से कम की सिफारिश की जाती है। एक उपयुक्त जांच घनत्व दिखाने वाले उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग (विशेष रूप से, चित्रा 6) देखें। विश्लेषण विधि एकल फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन अणुओं पर भी लागू होती है जो जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में अलग हो जाती है।

SMFRET प्रयोगों का एक महत्वपूर्ण पहलू FRET जांच का उत्पादन और लक्षण वर्णन स्वयं है। एक FRET जोड़ी के लिए fluorophores का चयन करते समय, उनके Förster त्रिज्या अपेक्षित अंतर डाई दूरी ⁴³ से मेल खाना चाहिए. फोटोब्लीचिंग के लिए प्रतिरोधी रंजक को पसंद किया जाता है क्योंकि वे लंबे समय तक निशान प्राप्त करते हैं। हालांकि, उन्नत ब्लीचिंग दरों के लिए, एक फ्लोरोफोर प्रजातियों का उपयोग स्टेपवाइज फोटोब्लीचिंग विश्लेषण के माध्यम से कोलोकलाइज्ड अणुओं से उत्पन्न होने वाली मल्टीएमिटर घटनाओं को पहचानने के लिए किया जा सकता है; प्रोटोकॉल अनुभाग में चरण 8.1.4 देखें। फ्लोरोफोर जोड़े साइट-विशेष रूप से और सहसंयोजक रूप से ब्याज के अणुओं से जुड़े होने चाहिए, इंट्रा- या इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट जोड़े बनाते हैं।

अन्य आसानी से उपलब्ध तकनीकों के साथ smFRET के संयोजन से विवर्तन सीमा (^STED44 के माध्यम से) से परे अपने स्थानिक संकल्प को बढ़ाया जा सकता है। यहां प्रस्तुत smFRET ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म नए प्रयोगात्मक सेटिंग्स और मॉडल सिस्टम के लिए दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को चौड़ा करता है। इसमें (i) मोबाइल बायोमोलेक्यूल्स के स्टोइकोमेट्री में गतिज परिवर्तन, (ii) मोबाइल बायोमोलेक्यूल्स का गतिशील संबंध, (iii) स्वतंत्र रूप से अलग-अलग अभिकारकों की एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं की दर, और (iv) मोबाइल बायोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक परिवर्तनों के कैनेटीक्स का अध्ययन शामिल है। पहले दो उदाहरणों के लिए मॉडल सिस्टम की आवश्यकता होती है जो इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट दिखाते हैं, यानी, दाता और स्वीकर्ता को ब्याज की बायोमोलेक्यूलर संस्थाओं को अलग करने के लिए संयुग्मित किया जाता है। उत्तरार्द्ध उदाहरण एक ही आणविक इकाई (इंट्रामोलेक्यूलर फ्रेट) के भीतर दाता और स्वीकर्ता को ले जाने वाले बायोसेंसर का उपयोग कर सकते हैं।

इंट्रामोलेक्यूलर FRET-आधारित सेंसर बायोमोलेक्यूल्स ^1,2,3,4 के आंतरिक संरचनात्मक परिवर्तनों, अंतर्जात या बाहरी बल लोड (आणविक बल सेंसर ¹⁶) के कारण होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों, या नैनो-पर्यावरण में आयन सांद्रता जैसे कैल्शियम 45 और पीएच ⁴⁶ में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते ^हैं। . मॉडल प्रणाली और पसंदीदा एंकरिंग प्लेटफ़ॉर्म के आधार पर, इस तरह की smFRET घटनाओं को या तो 2D या 3D में ट्रैक किया जा सकता है: (i) smFRET घटनाओं के प्लानर ट्रैकिंग को प्लाज्मा झिल्ली के भीतर रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन समय के परिमाणीकरण के लिए नियोजित किया जा सकता है, झिल्ली-लंगर वाले सिग्नल प्रवर्धन कैस्केड का संबंध, और सतह रिसेप्टर्स के स्टोइकोमेट्री परिवर्तन; (ii) एसएमएफआरईटी घटनाओं की मात्रा ट्रैकिंग का उपयोग जीवित कोशिकाओं या इन विट्रो पुनर्गठित प्रणालियों में किसी भी इंट्रा- या इंटरमॉलिक्युलर फ्रेट जांच के लिए किया जा सकता है।

smFRET ट्रैकिंग विधि मुख्य रूप से दिमाग में intramolecular FRET जांच के साथ विकसित किया गया था। इन जांचों में फ्लोरोसेंट लेबल की एक निश्चित और अच्छी तरह से ज्ञात संख्या होती है, एक तथ्य जो समूहीकृत और गलत तरीके से संश्लेषित (जैसे, अपूर्ण रूप से लेबल किए गए) अणुओं से डेटा को अस्वीकार करने के लिए शोषण किया गया था, साथ ही साथ जांच से जहां फ्लोरोफोर में से एक को फोटोब्लीच किया गया है। हालांकि, फ़िल्टरिंग चरणों को समायोजित करके, विधि को इंटरमॉलिक्युलर FRET जांच पर भी लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, केवल एक ही दाता और एक एकल स्वीकर्ता फ्लोरोफोर की विशेषता वाले अणुओं को स्वीकार करने के बजाय, कोई भी दाता और स्वीकर्ता रंजक के स्थानिक प्रक्षेपवक्रों की जांच कर सकता है और उदाहरण के लिए, दाता-स्वीकर्ता प्रक्षेपवक्रों को सह-अलग करने के लिए चुन सकता है।

चूंकि 3D-DAOSTORM एल्गोरिथ्म में उत्सर्जन बीम पथ में एक बेलनाकार लेंस के कारण अस्थिरता के माध्यम से ऑप्टिकल अक्ष के साथ सिग्नल की स्थिति का निर्धारण करने के लिए समर्थन है, 3 डी प्रयोगों को आसानी से विश्लेषण पाइपलाइन में एकीकृत किया जा सकता है। इस मामले में, स्वीकर्ता उत्तेजना पर स्वीकर्ता संकेत स्टोइकोइमेट्री और अक्षीय स्थिति को निर्धारित करने के लिए काम करेगा। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को स्वचालन और फ़िल्टरिंग योजनाओं की अपनी बड़ी डिग्री का उपयोग करके स्थिर जांच की विशेषता वाले प्रयोगों से डेटा का मूल्यांकन करने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। वास्तव में, जेल-चरण बाईलेयर ³⁸ पर स्थिर होलिडे जंक्शनों से smFRET दक्षता डेटासेट का विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के शुरुआती संस्करण का उपयोग करके किया गया था।

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer microscope body	Zeiss
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET570/60m	donor emission filter
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET675/50m	acceptor emission filter
conda-forge	conda-forge community		community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Dichroic mirror	Semrock Inc	FF640-FDi01-25×36	separation of donor and acceptor emission
Dichroic mirror (quad band)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25×36	separation of excitation and emission light
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	for imaging buffer
fret-analysis	Schütz group at TU Wien		Python package for smFRET data analysis; version 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	for imaging buffer
iBeam Smart 405-S 405 nm laser	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD camera	Andor Technology Ltd
Lab-Tek chambers (8 wells)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	for sample preparation and imaging
Millenia Prime 532 nm laser	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Python 3 distribution. Min. version: 3.7
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm laser	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	for imaging buffer
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schütz group at TU Wien		Python library for data analysis; version 17
TetraSpek bead size kit	Thermo Fisher Scientific	T14792	Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration
USC500TH Ultrasound bath	VWR		for SUV formation