הקמת מודל דלקת לבלב חריפה חמורה עכבר באמצעות הזרקה מדרדרת של נתרן Taurocholate לתוך צינור ביליופנקראטי
Summary
מודל עכבר של דלקת לבלב חריפה חמורה מתואר כאן. ההליך המוצג כאן הוא מהיר מאוד, פשוט ונגיש, ובכך עשוי לאפשר את חקר המנגנונים המולקולריים והתערבויות טיפוליות שונות בדלקת הלבלב החריפה בצורה נוחה.
Abstract
השכיחות של דלקת לבלב חריפה (AP), במיוחד דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP), גדלה בקבוצות גיל צעירות מדי שנה. עם זאת, קיים מחסור בטיפולים יעילים בפרקטיקה הקלינית הנוכחית. עם הנגישות הקלה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן, המאפשר מינונים מינימליים של תרופות הנדרשות להערכת vivo , מודל ניסיוני מבוסס היטב בעכברים עדיף למחקר AP. יתר על כן, SAP המושרה באמצעות נתרן taurocholate (TC) הוא כיום אחד הדגמים הנפוצים ביותר המאופיינים ביותר. מודל זה נחקר על טיפולים חדשניים ואירועים מולקולריים אפשריים במהלך התהליך של AP. כאן, אנו מציגים את הדור של מודל עכבר AP באמצעות נתרן taurocholate ו microsyringe תוצרת בית פשוטה. יתר על כן, אנו מספקים גם את המתודולוגיה לבדיקות ההיסטולוגיה והסראולוגיות הבאות.
Introduction
דלקת לבלב חריפה (AP) היא דלקת חריפה של הלבלב המאופיינת על ידי חסימה של צינור הלבלב הראשי עם התנפחות דביקה דביקה לאחר מכן ו autodigestion הלבלב על ידי אנזימים המופעלים באופן חריג שלה. הביטויים הקליניים שלה כוללים דלקת מקומית או מערכתית, כאבי בטן, והעלאה של עמילאז בסרום1,2. על פי סיווג החומרה3, AP יכול להציג בצורות קלות, מתונות וחמורות, וביניהם, דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP) היא המצב המדאיג ביותר בשל שיעור התמותה הגבוה שלה של יותר מ -30%4. בארצות הברית, AP היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר לאשפוז, המשפיעים על מעל 200,000 חולים5. יתר על כן, AP, במיוחד SAP, גדל מדי שנה ומשפיע על קבוצות גיל צעירות6. עם זאת, קיים מחסור באפשרויות טיפול יעילות בפרקטיקה הקלינית הנוכחית6,7. לכן, יש צורך לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים AP, ובכך להקל על שיפור הטיפול.
מודלים מבוססים של בעלי חיים ניסיוניים נדרשים לחקר המנגנונים המעורבים ב- AP ולהערכת האפקטיביות של שיטות טיפול שונות. עם הנגישות הקלה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן, אשר ממזער את המינונים של תרופות הנדרשות להערכת vivo, עכברים עדיפים למחקר AP. לכן, מספר מודלים של AP פותחו בעכברים8,9.
עובד ממודל עכבר לבלב מתון המושרה באמצעות הממשל תוך ורידי של caerulein10, Niederau ואח ‘פיתח מודל עכבר SAP שהוצג עם נמק תא acinar המושרה באמצעות אותה תרופה מסלול הזרקה11. למרות שלמודל זה יש מספר יתרונות, כולל אי-פולשניות, אינדוקציה מהירה, רבייה רחבה ותחולת, החיסרון העיקרי הוא שרק צורה קלה של AP מפותחת ברוב המקרים, ובכך מגבילה את הרלוונטיות הקלינית שלה. אלכוהול נחשב לאחד הגורמים האטיולוגיים העיקריים של AP; עם זאת, Foitzik ואח ‘ דיווח כי זה גורם לפגיעה בלבלב רק בשילוב עם גורמים אחרים, כגון גירוי יתר אקסוקריני12. יתר על כן, למרות מודלים AP המושרה אלכוהול שפותחו באמצעות נתיבי ממשל שונים, ומנות סמים דווחו13,14,15, החיסרון העיקרי שלהם הוא הקושי לשחזר אותם. ניהול intraperitoneal של L-ארגנין יכול גם לגרום AP בעכברים16; עם זאת, הרלוונטיות הקלינית הנמוכה שלה מעכבת את היישום שלה. Taurocholate, מלח מרה, הוצע לראשונה על ידי Creutzfeld ואח ‘בשנת 1965 לגרימת מצב הדומה AP אנושי באמצעות עירוי צינור הלבלב17. למרות שקיימות מחלוקות לגבי הרלוונטיות הקלינית שלה בפתופיזיולוגיה18,19, דלקת הלבלב הנגרמת על ידי טאורוכולאט נותרה מודל חיוני עבור SAP.
כמו מודל זה הוא פשוט למימוש והוא גם יעיל בעכברים, זה עכשיו אחד המודלים הנפוצים ביותר AP עבור בעלי חיים קטנים במחקרים vivo. Perides ואח ‘ העסיקה נתרן טאורוכולאט (TC) כדי לגרום SAP בעכברים20, מתן תובנות כדי להבין את הפתולוגיה שלה. בשילוב עם טכניקות שינוי גנטי, מודל זה אפשר לנו לאשר מספר גנים ספציפיים המעורבים AP. לדוגמה, Bicozo ואח ‘ הראה כי נוקאאוט של הגן CD38 מוגן מפני מודל של דלקת לבלב עירוי TC וייחס את המנגנונים לשינויים Ca2 + איתות תאיים21. Fanczal ואח ‘ חקר את ההשלכות הפיזיולוגיות של ביטוי TRPM2 בקרום הפלזמה של אצינר לבלב עכבר ותאים דביקים, והפגין חומרה מופחתת של SAP המושרה TC בעכברים נוקאאוט TRPM222. יתר על כן, מודל זה מספק גם דרך פשוטה ויעילה לבדוק תרופות חדשניות רבות ב vivo. לדוגמה, שיטה זו אפשרה אימות של ההשפעות הטיפוליות של קפאין23, חומצה דהידרוקולית24, ונוגדי חמצון שונים ונוגדי קרישה25,26. ראיה זו מדגימה את הרב-תכליתיות של מודל SAP המושרה על-ידי TC. למרות ש-Wittel et al. תיארו מודל עכבר דומה27, היעדר פרטים על הליכי היישום עלול לגרום לחוסר יכולת לשחזר את הממצאים. במאמר זה, אנו מתמקדים בשיטות המשתמשות במיקרו-מזרק ביתי פשוט ולומדים SAP המושרה על ידי TC, ובכך מספקים הדרכה אפשרית לא רק למחקר נוסף של הפתוגנזה והטיפול ב- AP, אלא גם לשיטה ניסיונית הניתנת להתאמה מושלמת עבור חומרים רבים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל SAP המושרה על ידי TC הוא כלי מחקר מצוין. כפי שמוצג במחקר זה, מודל זה מתממש בקלות רבה במעבדות כלליות מבלי להשתמש במכשירים ספציפיים. כאשר נעשה בו שימוש בשילוב עם היסטולוגיה וניתוח ביוכימי, הוא מספק עלות – (ריאגנטים זולים) וחיסכון בזמן (חלון זמן של 24 שעות) לגרימת והערכה של AP. התאמת הריכוז של TC מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על התמיכה מהמענקים הבאים: מענק מחקר תרגומי של NCRCH [2020WSA01], מענק מדעי KJXW מוועדת הבריאות של סוג’ואו לחוקרים צעירים [KJXW2020002], תוכנית מדע וטכנולוגיה של סוג’ואו סיטי (SKY2021038 ו- SKJY2021050), מענק מטעם תוכנית הלימודים האקדמית המועדפת לפיתוח מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג’יאנגסו (PAPD), ותוכנית מחקר ופיתוח חברתי ראשוני של מחוז ג’יאנגסו (BE2018659).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
