Injektion von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stromazellen mittels Wasserstrahltechnologie

Summary

Wir stellen eine Methode der Zellinjektion mittels nadelfreier Wasserstrahltechnologie vor, die mit einer Folge von Untersuchungen nach der Entbindung in Bezug auf Zelllebensfähigkeit, Proliferation und Elastizitätsmessungen verbunden ist.

Abstract

Harninkontinenz (UI) ist eine weit verbreitete Erkrankung, die durch den Mangel des Harnröhrenschließmuskels gekennzeichnet ist. Regenerative Medizinzweige, insbesondere die Zelltherapie, sind neuartige Ansätze zur Verbesserung und Wiederherstellung der Funktion des Harnröhrenschließmuskels. Obwohl die Injektion aktiver funktioneller Zellen routinemäßig in klinischen Umgebungen mit Nadel und Spritze durchgeführt wird, haben diese Ansätze erhebliche Nachteile und Einschränkungen. In diesem Zusammenhang ist die Technologie des nadelfreien Wasserstrahls (WJ) eine praktikable und innovative Methode, die lebensfähige Zellen durch visuell geführte Zystoskopie in den Harnröhrenschließmuskel injizieren kann. In der vorliegenden Studie haben wir WJ verwendet, um porcine Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen (pADSCs) in kadaverisches Harnröhrengewebe zu liefern und anschließend die Wirkung der WJ-Abgabe auf die Zellausbeute und -lebensfähigkeit zu untersuchen. Wir bewerteten auch die biomechanischen Eigenschaften (d.h. Elastizität) durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) Messungen. Wir zeigten, dass die von WJ gelieferten pADSCs in ihrer zellulären Elastizität signifikant reduziert waren. Die Lebensfähigkeit war im Vergleich zu Kontrollen deutlich geringer, liegt aber immer noch über 80%.

Introduction

Harninkontinenz (UI) ist eine weit verbreitete Erkrankung mit einer Prävalenz von 1,8 – 30,5% in der europäischen Bevölkerung 1 und ist in erster Linie durch Fehlfunktionen des Harnröhrenschließmuskels gekennzeichnet^. Aus klinischer Sicht wird Patienten häufig eine chirurgische Behandlung angeboten, wenn konservative Therapien oder Physiotherapie die auftretenden Symptome nicht ansprechen und lindern.

Die Zelltherapie zur möglichen regenerativen Reparatur der Fehlfunktion des Schließmuskelkomplexes hat sich zu einem avantgardistischen Ansatz für die Behandlung der UI-Pathologie^{entwickelt 2,3}. Seine Hauptziele sind der Ersatz, die Reparatur und die Wiederherstellung der biologischen Funktionalität des beschädigten Gewebes. In Tiermodellen für UI hat die Stammzelltransplantation vielversprechende Ergebnisse bei urodynamischen Ergebnissen^gezeigt 2,4,5. Stammzellen entstehen als optimale zelluläre Kandidaten, da sie die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und multipotenten Differenzierung haben und so die betroffene Geweberegeneration unterstützen⁶. Trotz des bevorstehenden regenerativen Potenzials bleibt der praktische Einsatz der Zelltherapie behindert, da die minimal-invasive Abgabe von Zellen immer noch vor mehreren Herausforderungen hinsichtlich der Injektionspräzision und der Abdeckung des Ziels steht. Obwohl der derzeitige Ansatz für die Zellabgabe die Injektion durch ein Nadelspritzensystem⁷ ist, führt dies in der Regel zu einem Gesamtdefizit an lebensfähigen Zellen, wobei die berichteten Lebensfähigkeiten nach der Transplantation nur 1% bis 31% betragen⁸. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Zellabgabe über die Nadelinjektion auch die Platzierung, die Retentionsrate sowie die Verteilung der transplantierten Zellen in das Zielgewebe beeinflusst ^9,10,11. Ein praktikabler, neuartiger Ansatz, der die oben genannte Einschränkung überwindet, ist die nadelfreie Zellabgabe mittels Wasserstrahltechnologie.

Die Waterjet (WJ) -Technologie entwickelt sich zu einem neuen Ansatz^, der eine Hochdurchsatzabgabe von Zellen per Zystoskop unter visueller Kontrolle im Harnröhrenschließmuskel^{ermöglicht 12,13}. Der WJ ermöglicht die Zellabgabe bei unterschiedlichen Drücken (E = Effekte in bar) von E5 bis E80¹³. In der ersten Phase (Gewebepenetrationsphase) wird isotonische Lösung mit hohem Druck (d.h. E60 oder E80) aufgetragen, um die extrazelluläre Matrix, die das Gewebe umgibt, gezielt zu lockern und kleine miteinander verbindende Mikrolücken zu öffnen. In der zweiten Phase (der Injektionsphase) wird der Druck innerhalb von Millisekunden gesenkt (d.h. bis zu E10), um die Zellen schonend in das Zielgewebe zu bringen. Nach dieser zweistufigen Anwendung werden die Zellen beim Ausstoßen keinem zusätzlichen Druck gegen das Gewebe ausgesetzt, sondern schweben in einem Niederdruckstrom in einen flüssigkeitsgefüllten kavernösen Bereich¹³. In einem Ex-vivo-Modell, in dem Stammzellen über WJ in das kadaverische Harnröhrengewebe injiziert wurden, konnten lebensfähige Zellen anschließend aspiriert und aus dem Gewebe gewonnen und in vitro¹³ weiter ausgebaut werden. Obwohl eine Studie von Weber et al. aus dem Jahr 2020 die Machbarkeit und Anwendbarkeit von WJ zur Bereitstellung von Fußabdruck-freien Kardiomyozyten in das Myokard¹⁴ gezeigt hat, muss berücksichtigt werden, dass sich die WJ-Technologie noch in einem Prototypenstadium befindet.

Das folgende Protokoll beschreibt, wie Schweinefettgewebe-abgeleitete Stromazellen (pADSC) hergestellt und markiert werden und wie sie über die WJ-Technologie und Williams-Zystoskopie-Nadeln (WN) in Capture-Fluid- und Leichengewebe abgegeben werden. Nach der zellulären Injektion wird die zelluläre Vitalität und Elastizität mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) beurteilt. Über Schritt-für-Schritt-Anleitungen bietet das Protokoll einen klaren und prägnanten Ansatz zur Erfassung zuverlässiger Daten. Der Diskussionsteil stellt die wichtigsten Vorteile, Einschränkungen und Zukunftsperspektiven der Technik vor und beschreibt sie. Die WJ-Abgabe von Zellen sowie die hier berichteten Folgeanalysen nach der Translation ersetzen die Standardnadelinjektion und bieten einen soliden Zellabgaberahmen für die regenerative Heilung des Zielgewebes. In unseren jüngsten Studien haben wir den Nachweis erbracht, dass WJ Zellen im Vergleich zu Nadelinjektionen^15,16 präziser und zumindest mit vergleichbarer Lebensfähigkeit lieferte.

Protocol

Die Proben des Schweinefettgewebes stammen vom Institut für Experimentelle Chirurgie der Universität Tübingen. Alle Verfahren wurden von den örtlichen Tierschutzbehörden unter der Tierversuchsnummer CU1/16 genehmigt. 1. Isolierung von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stromazellen Verwenden Sie porcines Fettgewebe, das vom Institut für Experimentelle Chirurgie in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen an das Labor geliefert wird. Das Gewebe in eine sterile …

Representative Results

Nach der Zellabgabe über die beiden Ansätze war die Lebensfähigkeit der über die WN gelieferten Zellen (97,2 ± 2%, n=10, p<0,002) höher als bei Injektionen durch WJ unter Verwendung der E60-10-Einstellungen (85,9 ± 0,16%, n=12) (Abbildung 2). Die Ergebnisse der biomechanischen Bewertung zeigten, dass: WN-Injektionen von Zellen in Einfangflüssigkeit zeigten keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Elastizitätsmodule (EM; 0,992 kPa) im Vergleich zu den Kontrollen (1,176 kPa; …

Discussion

In der vorliegenden Studie demonstrierten und präsentierten wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz für das WJ-Zellabgabeverfahren und verwendeten eine Folge quantitativer Untersuchungen, um den Einfluss der WJ-Abgabe auf die zellulären Eigenschaften zu bewerten: zelluläre Lebensfähigkeit und biomechanische Merkmale (d.h. EM). Nach der WJ-Injektion waren 85,9% der geernteten Zellen lebensfähig. In Bezug auf die WN-Injektion behielten 97,2% der Zellen ihre Lebensfähigkeit nach der Injektion bei. Damit erfüllt der WJ…

Materials

50 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	227261
1 mL BD Luer-LokTM Syringe	BD Plastik Inc	n.a.
100 µm cell sieve	Greiner BioOne	542000
15 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	188271
75 cm2 tissue culture flask	Corning Incorporated	353136
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
AFM processing software	Bruker	JPK00518
AFM software	Bruker	JPK00518
AFM system Cell Hesion 200	Bruker	JPK00518
All-In-One-Al cantilever	Budget Sensors	AIO-10	tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm)
Amphotericin B solution	Sigma	A2942	250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
BD Microlance 3 18G	BD	304622
bovine serum albumin	Gibco	A10008-01
Cantilever	All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10	tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometer	NanoEnTek	631-1098
centrifuge: Rotina 420R	Hettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose	Sigma	D5546
Feather disposable scalpel (No. 10)	Feather	02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
HEPES sodium salt solution (1 M)	Sigma	H3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
laboratory bags	Brand	759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine	Merck	F1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
L-glutamine	Lonza	BE 17-605C1	200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	L3224	Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6	Zeiss
Microscope: AxioVertA.1	Zeiss
Nelaton-Catheter female	Bicakcilar	19512051
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFM	Bruker	T-05-0117
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22	IBM
Sterile Petri dish – CellStar	Greiner BioOne	664160
Tissue culture dishes	TPP AG	TPP93040
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl	Lonza	17-942E
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
Waterjet: ERBEJET2 device	Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection Needle	Cook Medical	G14220	23G, 5.0 Fr, 35 cm