הזרקת תאי סטרומה שמקורם ברקמת שומן חזירית באמצעות טכנולוגיית Waterjet
Summary
אנו מציגים שיטה להזרקת תאים באמצעות טכנולוגיית הזרקת מים ללא מחט יחד עם המשך של חקירות לאחר הלידה במונחים של כדאיות תאית, התפשטות ומדידות גמישות.
Abstract
בריחת שתן (UI) היא מצב שכיח מאוד המאופיין במחסור בשריר הסוגר בשופכה. ענפי הרפואה הרגנרטיבית, ובמיוחד הטיפול בתאים, הם גישות חדשניות לשיפור ושיקום תפקוד הסוגר בשופכה. למרות שהזרקה של תאים פונקציונליים פעילים מתבצעת באופן שגרתי במסגרות קליניות על ידי מחט ומזרק, לגישות אלה יש חסרונות ומגבלות משמעותיות. בהקשר זה, טכנולוגיית הזרקת מים ללא מחטים (WJ) היא שיטה אפשרית וחדשנית שיכולה להזריק תאים בני קיימא על ידי ציסטוסקופיה מונחית חזותית בסוגר השופכה. במחקר הנוכחי, השתמשנו ב-WJ כדי להעביר תאים סטרומליים שמקורם ברקמת השומן החזירי (pADSCs) לתוך רקמת השופכה הקדבורית, ולאחר מכן חקרנו את ההשפעה של אספקת WJ על תפוקת התאים ועל הכדאיות שלהם. הערכנו גם את התכונות הביו-מכניות (כלומר, גמישות) על ידי מדידות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). הראינו כי מחשבי ה-pADSCs של WJ הופחתו באופן משמעותי בגמישות התאית שלהם. הכדאיות הייתה נמוכה משמעותית בהשוואה לבקרות, אך היא עדיין מעל 80%.
Introduction
בריחת שתן (UI) היא הפרעה נפוצה עם שכיחות של 1.8 – 30.5% באוכלוסיות אירופה1 ומאופיינת בעיקר על ידי תקלה של הסוגר השופכה. מנקודת מבט קלינית, טיפול כירורגי מוצע לעתים קרובות לחולים כאשר טיפולים שמרניים או פיזיותרפיה אינם מצליחים לטפל ולהקל על הסימפטומים המתעוררים.
טיפול תאי לתיקון רגנרטיבי פוטנציאלי של תקלה בקומפלקס הסוגר התגלה כגישה אוונגרדית לטיפול בפתולוגיה של ממשק משתמש 2,3. מטרותיו העיקריות הן להחליף, לתקן ולשחזר את הפונקציונליות הביולוגית של הרקמה הפגועה. במודלים של בעלי חיים עבור ממשק משתמש, השתלת תאי גזע הראתה תוצאות מבטיחות בתוצאות אורודינמיות 2,4,5. תאי גזע מתעוררים כמועמדים תאיים אופטימליים שכן יש להם את היכולת לעבור התחדשות עצמית והתמיינות רב-פוטנטית, ובכך לסייע להתחדשות הרקמה הפגועה6. למרות הפוטנציאל הרגנרטיבי הצפוי, השימוש המעשי בטיפול בתאים נותר מעוכב מכיוון שמסירה זעיר פולשנית של תאים עדיין מתמודדת עם מספר אתגרים הנוגעים לדיוק ההזרקה ולכיסוי המטרה. אף על פי שהגישה הנוכחית המשמשת להעברת תאים היא הזרקה דרך מערכת מזרק מחט7, היא בדרך כלל גורמת לגירעון כולל של תאים בני קיימא, כאשר הכדאיות המדווחת נמוכה עד כדי 1%-31% לאחרההשתלה 8. בנוסף, הודגם כי העברת תאים באמצעות הזרקת מחט משפיעה גם על המיקום, על קצב השמירה, כמו גם על התפלגות התאים המושתלים לתוך הרקמה הממוקדת 9,10,11. גישה ריאלית וחדשנית המתגברת על המגבלה הנ”ל היא אספקת תאים ללא מחט באמצעות טכנולוגיית סילון מים.
טכנולוגיית Waterjet (WJ) מתפתחת כגישה חדשה המאפשרת העברת תפוקה גבוהה של תאים על ידי ציסטוסקופ תחת שליטה חזותית בסוגר השופכה12,13. ה- WJ מאפשר העברת תאים בלחצים שונים (E = אפקטים בסרגל) הנעים בין E5 ל- E8013. בשלב הראשון, (שלב חדירת רקמות) תמיסה איזוטונית מופעלת בלחץ גבוה (כלומר, E60 או E80) על מנת לשחרר את המטריצה החוץ-תאית המקיפה את הרקמה הממוקדת ולפתוח מיקרו-לקונה מקשרת קטנה. בשלב השני (שלב ההזרקה), הלחץ יורד תוך אלפיות השנייה (כלומר, עד E10) על מנת להעביר בעדינות את התאים לתוך הרקמה הממוקדת. בעקבות יישום דו-שלבי זה, התאים אינם נתונים ללחץ נוסף על הרקמה כאשר הם נפלטים, אלא צפים בזרם בלחץ נמוך לתוך אזור מערות מלא בנוזל13. במסגרת מודל ex vivo שבה תאי גזע הוזרקו דרך WJ לתוך רקמת השופכה הקדברית, ניתן היה לשאוף לאחר מכן תאים בני קיימא ולשלוף אותם מהרקמה ולהרחיב עוד יותר במבחנה13. למרות שמחקר שנערך בשנת 2020 על ידי Weber et al. הדגים את ההיתכנות והישימות של WJ לספק קרדיומיוציטים ללא טביעת רגל לתוך שריר הלב14, יש לזכור שטכנולוגיית WJ עדיין נמצאת בשלב אב טיפוס.
הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין ולתייג תאים סטרומליים שמקורם ברקמת שומן חזירי (pADSC) וכיצד להעביר אותם לתוך נוזל לכידה ורקמה קדברית באמצעות טכנולוגיית WJ ומחטי ציסטוסקופיה של ויליאמס (WN). לאחר ההזרקה התאית, מעריכים את החיוניות התאית והגמישות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). באמצעות הוראות שלב אחר שלב, הפרוטוקול נותן גישה ברורה ותמציתית להשגת נתונים אמינים. פרק הדיון מציג ומתאר את היתרונות, המגבלות והפרספקטיבות העתידיות של הטכניקה. העברת התאים על ידי WJ, כמו גם ניתוחי ההמשך לאחר התרגום המדווחים כאן, מחליפים את הזרקת המחט הסטנדרטית ומספקים מסגרת אספקת תאים מוצקה לריפוי רגנרטיבי של רקמת המטרה. במחקרים האחרונים שלנו סיפקנו ראיות לכך ש-WJ העביר תאים בצורה מדויקת יותר ולפחות בכדאיות דומה בהשוואה לזריקות מחט 15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי, הדגמנו והצגנו גישה שלב אחר שלב להליך מסירת תאי WJ והשתמשנו בהמשך של מחקרים כמותיים כדי להעריך את ההשפעה של אספקת WJ על מאפיינים תאיים: כדאיות תאית ותכונות ביומכניות (כלומר, EM). לאחר הזרקת WJ, 85.9% מהתאים שנקטפו היו בני קיימא. במונחים של הזרקת WN, 97.2% מהתאים שמרו על הכדאיות שלהם לאחר הה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם.
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
