ウォータージェット技術によるブタ脂肪組織由来間質細胞の注入
Summary
我々は、無針ウォータージェット技術による細胞注射の方法と、細胞生存率、増殖、および弾性測定の観点からの送達後調査の後遺症と組み合わせた方法を提示する。
Abstract
尿失禁(UI)は、尿道括約筋の欠乏を特徴とする非常に一般的な状態である。再生医療の枝、特に細胞療法は、尿道括約筋機能を改善および回復させるための新しいアプローチです。活性機能細胞の注射は、臨床現場で針および注射器によって日常的に行われているが、これらのアプローチには重大な欠点および限界がある。この文脈において、無針ウォータージェット(WJ)技術は、尿道括約筋に視覚的誘導膀胱鏡検査によって生細胞を注入することができる実現可能で革新的な方法である。本研究では、WJを用いてブタ脂肪組織由来間質細胞(pADSC)を死体尿道組織に送達し、その後、WJ送達が細胞収量および生存率に及ぼす影響を調査した。我々はまた、原子間力顕微鏡(AFM)測定によって生体力学的特徴(すなわち、弾性)を評価した。我々は、WJ送達されたpADSCsが細胞弾性において有意に低下することを示した。生存率は対照と比較して有意に低かったが、依然として80%を超えている。
Introduction
尿失禁(UI)は、ヨーロッパ集団1 における有病率が1.8〜30.5%の広範な疾患であり、主に尿道括約筋の機能不全によって特徴付けられる。臨床的観点からは、外科的治療は、保守的な治療法または理学療法が新たな症状に対処し、緩和できない場合に患者に提供されることが多い。
括約筋複合体の潜在的な再生修復のための細胞療法は、UI病理2、3の治療のための前衛的なアプローチとして浮上している。その主な目標は、損傷した組織の生物学的機能を置換、修復および回復させることである。UIのための動物モデルにおいて、幹細胞移植は、尿力学的転帰において有望な結果を示している2,4,5。幹細胞は、自己複製および多能性分化を受ける能力を有するため、最適な細胞候補として生じ、したがって、罹患組織再生6を補助する。来るべき再生の可能性にもかかわらず、細胞の低侵襲送達は依然として標的の注入精度およびカバレッジに関するいくつかの課題に直面しているため、細胞療法の実用化は依然として妨げられている。細胞送達に使用される現在のアプローチは、針注射器システム7を介した注射であるにもかかわらず、それは通常、生細胞の全体的な欠損をもたらし、移植後の生存率は1%〜31%と低いと報告されている8。加えて、針注射を介した細胞送達は、標的組織への移植細胞の配置、保持率、ならびに分布に影響を与えることも示されている9、10、11。上記の制限を克服する実現可能で斬新なアプローチは、ウォータージェット技術を介した無針細胞送達である。
ウォータージェット(WJ)技術は、尿道括約筋12、13における視覚的制御下での膀胱鏡による細胞のハイスループット送達を可能にする新しいアプローチとして浮上しつつある。WJは、E5からE8013までの異なる圧力(E = バーの効果)での細胞送達を可能にします。第1相では、等張溶液(組織浸透相)は、組織標的および開放された小さな相互連結マイクロラクナを囲む細胞外マトリックスを緩めるために高圧(すなわち、E60またはE80)で適用される。第2段階(注入段階)では、細胞を標的組織に穏やかに送達するために、圧力をミリ秒以内に(すなわち、E10まで)低下させる。この2つの段階的適用に続いて、細胞は、放出されるときに組織に対して追加の圧力を受けるのではなく、液体充填海綿状領域13に低圧流中に浮遊する。幹細胞をWJを介して死体尿道組織に注入したエキソビボモデル設定では、生存細胞をその後吸引して組織から取り出し、インビトロでさらに拡大することができた13。Weberらによる2020年の研究では、フットプリントのない心筋細胞を心筋14に送達するためのWJの実現可能性と適用可能性が実証されましたが、WJ技術はまだプロトタイプ段階にあることに留意する必要があります。
以下のプロトコルは、ブタ脂肪組織由来間質細胞(pADSC)を調製および標識する方法、およびWJ技術およびウィリアムズ膀胱鏡検査針(WN)を介してそれらを捕捉液および死体組織に送達する方法を説明する。細胞注射後、原子間力顕微鏡(AFM)を介して細胞の活力および弾性が評価される。ステップバイステップの手順により、プロトコルは信頼性の高いデータを取得するための明確で簡潔なアプローチを提供します。ディスカッションセクションでは、この技術の主な利点、制限、および将来の見通しを提示し、説明します。ここで報告されたWJ細胞送達および後遺症翻訳後分析は、標準的な針注射に取って代わり、標的組織の再生治癒のための固体細胞送達フレームワークを提供する。我々の最近の研究では、針注射と比較して、WJがより正確かつ少なくとも同等の生存率で細胞を送達したという証拠を提供しました15,16。
Protocol
ブタ脂肪組織サンプルは、チュービンゲン大学の実験外科研究所から入手した。すべての手順は、動物実験番号CU1/16の下で地元の動物福祉当局によって承認された。 1. ブタ脂肪組織由来間質細胞の単離 実験外科学研究所から50mLの遠沈管に入れて実験室に届けたブタ脂肪組織を使用してください。 組織を滅菌ベンチの下の滅菌ペトリ皿に移し?…
Representative Results
2つのアプローチによる細胞送達に続いて、WN(97.2 ± 2%、n=10、p<0.002)を介して送達された細胞の生存率は、E60-10設定(85.9 ± 0.16%、n=12)を用いたWJによる注射と比較して高かった(図2)。生体力学的評価結果は、以下のことを示した:捕捉液中の細胞のWN注射は、対照(1.176kPa; 図3A)、WJ注射は細胞EMの有意な減少を誘発したが(0.440kPa、p<0.001、 図…
Discussion
本研究では、WJ細胞送達手順の段階的なアプローチを実証および提示し、WJ送達が細胞特性に及ぼす影響を評価するために定量的調査の後遺症を採用した:細胞生存率および生体力学的特徴(すなわち、EM)。WJ注射後、回収された細胞の85.9%が生存可能であった。WN注射に関しては、細胞の97.2%が注射後に生存率を保持していた。したがって、WJアプローチは、臨床実施のための絶対的な要件を満た…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
元の出版物の共著者の助けとサポートに感謝します。
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
Cite This Article
Knoll, J., Danalache, M., Linzenbold, W., Enderle, M., Abruzzese, T., Stenzl, A., Aicher, W. K. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology. J. Vis. Exp. (177), e63132, doi:10.3791/63132 (2021).