워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입

Summary

우리는 세포 생존력, 증식 및 탄력성 측정 측면에서 배달 후 조사의 후유증과 결합 된 바늘이없는 워터젯 기술을 통한 세포 주입 방법을 제시합니다.

Abstract

요실금 (UI)은 요도 괄약근 근육의 결핍을 특징으로하는 매우 보편적 인 상태입니다. 재생 의학 분야, 특히 세포 요법은 요도 괄약근 기능을 향상시키고 회복시키는 새로운 접근법입니다. 활성 기능성 세포의 주사가 바늘 및 주사기에 의해 임상 환경에서 일상적으로 수행되지만, 이러한 접근법은 상당한 단점과 한계를 가지고 있습니다. 이러한 맥락에서, 무바늘 워터젯 (WJ) 기술은 요도 괄약근에 시각적 인 안내 방광 내시경 검사로 생존 가능한 세포를 주입 할 수있는 실현 가능하고 혁신적인 방법입니다. 본 연구에서, 우리는 WJ를 사용하여 돼지 지방 조직 유래 기질 세포 (pADSCs)를 사체 요도 조직으로 전달하고 WJ 전달이 세포 수율 및 생존력에 미치는 영향을 조사했습니다. 우리는 또한 원자력 현미경 (AFM) 측정에 의해 생체 역학적 특징 (즉, 탄력성)을 평가했습니다. 우리는 WJ가 전달한 pADSC가 세포 탄력성에서 현저하게 감소한다는 것을 보여주었다. 생존력은 대조군에 비해 현저히 낮았지만 여전히 80% 이상이다.

Introduction

요실금 (UI)은 유럽 인구 1에서 1.8 – 30.5 %의 유병률을 가진 광범위한 장애이며 주로 요도 괄약근의 오작동이 특징입니다. 임상 적 관점에서 볼 때, 외과 적 치료는 종종 보존 적 치료법이나 물리 치료가 새로운 증상을 해결하고 완화시키지 못할 때 환자에게 제공됩니다.

괄약근 복합체 오작동의 잠재적인 재생 복구를 위한 세포 요법은 UI 병리학 ^2,3의 치료를 위한 아방가르드 접근법으로서 부각되고 있다. 주요 목표는 손상된 조직의 생물학적 기능을 대체, 복구 및 복원하는 것입니다. UI에 대한 동물 모델에서, 줄기 세포 이식은 비뇨 기역학적 결과 2,4,5에서 유망한 결과를 보여주었다. 줄기 세포는 자기 재생 및 분화 능력을 가질 수있는 능력을 가지고 있기 때문에 최적의 세포 후보로 발생하므로 영향을받는 조직 재생을 돕습니다⁶. 다가오는 재생 잠재력에도 불구하고, 세포의 최소 침습적 전달이 여전히 주사 정밀도 및 표적의 커버리지에 관한 몇 가지 도전에 직면함에 따라 세포 요법의 실질적인 사용은 여전히 방해 받고 있습니다. 세포 전달에 사용되는 현재의 접근법이 바늘 주사기 시스템⁽⁷)을 통한 주사임에도 불구하고, 일반적으로 생존 가능한 세포의 전반적인 결핍을 초래하며, 이식 후 1%-31%만큼 낮은 생존율을 보고하였다⁸. 또한, 바늘 주입을 통한 세포 전달은 또한 표적 조직 내로의 이식된 세포의 배치, 보유 속도 뿐만 아니라 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났다⁽9,10,11). 상기 언급된 한계를 극복하는 실현 가능하고 새로운 접근법은 워터젯 기술을 통한 무바늘 세포 전달이다.

워터젯 (WJ) 기술은 요도 괄약근^12,13에서 시각적 제어하에 방광경에 의한 세포의 높은 처리량 전달을 가능하게하는 새로운 접근법으로 부상하고 있습니다. WJ는 E5에서 E80¹³ 범위의 다양한 압력 (E = 효과 바)에서 셀 전달을 가능하게합니다. 첫 번째 단계에서, (조직 침투 단계) 등장성 용액은 표적화된 조직을 둘러싸고 있는 세포외 매트릭스를 느슨하게 하기 위해 고압 (즉, E60 또는 E80)으로 적용되고 작은 상호연결 마이크로락쿠내를 개방한다. 두 번째 단계 (주입 단계)에서, 압력은 세포를 표적화 된 조직 내로 부드럽게 전달하기 위해 밀리 초 이내에 (즉, E10까지) 낮아진다. 이 두 단계-상 적용에 이어서, 세포는 분출될 때 조직에 대해 추가적인 압력을 받지 않지만, 액체-충전된 동굴 영역⁽¹³) 내로 저압 스트림으로 부유된다. 줄기 세포가 WJ를 통해 사체 요도 조직으로 주입되는 생체외 모델 설정에서, 생존 가능한 세포는 나중에 흡인 및 조직으로부터 회수되고 시험관내¹³에서 더욱 확장될 수 있었다. Weber et al.의 2020 년 연구에서 발자국이없는 심근 세포를 심근¹⁴에 전달하는 WJ의 실현 가능성과 적용 가능성을 입증했지만 WJ 기술은 여전히 프로토 타입 단계에 있음을 명심해야합니다.

다음 프로토콜은 돼지 지방조직 유래 기질 세포(pADSC)를 준비하고 라벨링하는 방법과 WJ 기술 및 윌리엄스 방광내시경 바늘(WN)을 통해 포획액 및 사체 조직으로 전달하는 방법을 설명합니다. 세포 주사 후, 원자력 현미경 (AFM)을 통해 세포 활력과 탄력성이 평가됩니다. 단계별 지침을 통해 프로토콜은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 명확하고 간결한 접근 방식을 제공합니다. 토론 섹션에서는 기술의 주요 장점, 한계 및 향후 관점을 제시하고 설명합니다. 여기에 보고된 후유증 후 분석뿐만 아니라 세포의 WJ 전달은 표준 바늘 주입을 대체하고 표적 조직의 재생 치유를 위한 고체 세포 전달 프레임워크를 제공한다. 우리의 최근 연구에서 우리는 WJ가 바늘 주사^15,16과 비교할 때 세포를보다 정확하고 적어도 비슷한 생존력으로 전달했다는 증거를 제공했습니다.

Protocol

돼지 지방 조직 샘플은 Tuebingen 대학의 실험 수술 연구소에서 입수했습니다. 모든 절차는 동물 실험 번호 CU1/16에 따라 지역 동물 복지 당국에 의해 승인되었다. 1. 돼지 지방조직 유래 기질세포의 분리 실험 수술 연구소에서 전달된 돼지 지방 조직을 50mL 원심분리 튜브에서 실험실로 사용하십시오. 조직을 멸균 벤치 아래의 멸균 된 페트리 접시에 옮?…

Representative Results

두 가지 접근법을 통한 세포 전달 후, WN을 통해 전달된 세포의 생존율(97.2± 2%, n=10, p<0.002)은 E60-10 설정(85.9 ± 0.16%, n=12)을 사용하는 WJ에 의한 주사제와 비교했을 때 더 높았다(그림 2). 생체역학적 평가 결과는 다음과 같다는 것을 보여주었다: 포획 유체에서 세포의 WN 주사는 대조군과 비교했을 때 탄성 모듈리 (EM; 0.992 kPa)에 대하여 유의한 차이를 나타내지 않았다 (1.176 kPa; 도 …

Discussion

본 연구에서, 우리는 WJ 세포 전달 절차에 대한 단계별 접근법을 입증하고 제시했으며, 세포 특성에 대한 WJ 전달의 효과를 평가하기 위해 정량적 조사의 후유증을 채택했다 : 세포 생존력 및 생체 역학적 특징 (즉, EM). WJ 주사 후, 수확된 세포의 85.9%가 생존 가능하였다. WN 주사의 관점에서, 세포의 97.2 %는 주사 후 생존력을 유지했다. 따라서, WJ 접근법은 임상 구현을 위한 절대적 요건을 충족시킨다:…

Materials

50 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	227261
1 mL BD Luer-LokTM Syringe	BD Plastik Inc	n.a.
100 µm cell sieve	Greiner BioOne	542000
15 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	188271
75 cm2 tissue culture flask	Corning Incorporated	353136
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
AFM processing software	Bruker	JPK00518
AFM software	Bruker	JPK00518
AFM system Cell Hesion 200	Bruker	JPK00518
All-In-One-Al cantilever	Budget Sensors	AIO-10	tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm)
Amphotericin B solution	Sigma	A2942	250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
BD Microlance 3 18G	BD	304622
bovine serum albumin	Gibco	A10008-01
Cantilever	All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10	tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometer	NanoEnTek	631-1098
centrifuge: Rotina 420R	Hettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose	Sigma	D5546
Feather disposable scalpel (No. 10)	Feather	02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
HEPES sodium salt solution (1 M)	Sigma	H3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
laboratory bags	Brand	759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine	Merck	F1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
L-glutamine	Lonza	BE 17-605C1	200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	L3224	Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6	Zeiss
Microscope: AxioVertA.1	Zeiss
Nelaton-Catheter female	Bicakcilar	19512051
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFM	Bruker	T-05-0117
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22	IBM
Sterile Petri dish – CellStar	Greiner BioOne	664160
Tissue culture dishes	TPP AG	TPP93040
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl	Lonza	17-942E
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
Waterjet: ERBEJET2 device	Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection Needle	Cook Medical	G14220	23G, 5.0 Fr, 35 cm