Injeksjon av porcin adipose vev-avledede stromaceller via Waterjet Technology

Summary

Vi presenterer en metode for celleinjeksjon via nålfri vannjetteknologi kombinert med en oppfølger av undersøkelser etter levering når det gjelder cellulær levedyktighet, spredning og elastisitetsmålinger.

Abstract

Urininkontinens (UI) er en svært utbredt tilstand preget av mangelen på urinrørssfinktermuskelen. Regenerative medisingrener, spesielt celleterapi, er nye tilnærminger for å forbedre og gjenopprette urinrørssfinkterfunksjonen. Selv om injeksjon av aktive funksjonelle celler rutinemessig utføres i kliniske omgivelser med nål og sprøyte, har disse tilnærmingene betydelige ulemper og begrensninger. I denne sammenhengen er nålfri waterjet (WJ)-teknologi en gjennomførbar og innovativ metode som kan injisere levedyktige celler ved visuell guidet cystoskopi i urinrørssfinkteren. I den nåværende studien brukte vi WJ til å levere svine fettvevsavledede stromale celler (pADSCer) i kadaverisk urinrørsvev og undersøkte deretter effekten av WJ-levering på celleutbytte og levedyktighet. Vi vurderte også de biomekaniske egenskapene (dvs. elastisitet) ved målinger av atomkraftmikroskopi (AFM). Vi viste at WJ leverte pADSCer ble betydelig redusert i deres cellulære elastisitet. Levedyktigheten var betydelig lavere sammenlignet med kontroller, men er fortsatt over 80%.

Introduction

Urininkontinens (UI) er en utbredt lidelse med en prevalens på 1,8 – 30,5% i europeiske populasjoner¹ og er hovedsakelig preget av funksjonsfeil i urinrørssfinkteren. Fra et klinisk perspektiv tilbys kirurgisk behandling ofte til pasienter når konservative terapier eller fysioterapi ikke klarer å adressere og lindre de fremvoksende symptomene.

Celleterapi for potensiell regenerativ reparasjon av sphincterkompleksfeilen har dukket opp som en avantgarde-tilnærming for behandling av UI-patologi ^2,3. Hovedmålene er å erstatte, reparere og gjenopprette den biologiske funksjonaliteten til det skadede vevet. I dyremodeller for UI har stamcelletransplantasjon vist lovende resultater i urodynamiske utfall ^2,4,5. Stamceller oppstår som optimale cellulære kandidater som de har evnen til å gjennomgå selvfornyelse og multipotent differensiering, og dermed hjelpe den berørte vev regenerering⁶. Til tross for det kommende regenerative potensialet, forblir den praktiske bruken av celleterapi hindret, da minimal invasiv levering av celler fortsatt står overfor flere utfordringer med hensyn til injeksjonspresisjon og dekning av målet. Selv om den nåværende tilnærmingen som brukes til cellelevering er injeksjon gjennom et sprøytesystem⁷, resulterer det vanligvis i et samlet underskudd av levedyktige celler, med rapporterte viaevner så lave som 1%- 31% etter transplantasjon⁸. I tillegg har cellelevering via nåleinjeksjon også vist seg å påvirke plasseringen, oppbevaringsgraden, samt distribusjon av transplanterte celler i det målrettede vevet ^9,10,11. En gjennomførbar, ny tilnærming som overvinner ovennevnte begrensning er nålfri cellelevering via vannstråleteknologi.

Waterjet (WJ) teknologi dukker opp som en ny tilnærming som muliggjør høy gjennomstrømning levering av celler ved cystoskop under visuell kontroll i urinrør sphincter^12,13. WJ muliggjør cellelevering ved ulike trykk (E = effekter i bar) fra E5 til E80¹³. I den første fasen påføres (vevsinntrengningsfase) isotonisk løsning med høyt trykk (dvs. E60 eller E80) for å løsne den ekstracellulære matrisen rundt vevet som er målrettet og åpne små sammenkoblede mikro-laktuna. I den andre fasen (injeksjonsfasen) senkes trykket innen millisekunder (dvs. opp til E10) for å forsiktig levere cellene inn i det målrettede vevet. Etter denne to trinnfaseapplikasjonen blir cellene ikke utsatt for ekstra trykk mot vevet når de kastes ut, men flyter i en lavtrykksstrøm inn i et væskefylt huleområde¹³. I en ex vivo modell setting hvor stamceller ble injisert via WJ i kadaverisk urinrør vev, levedyktige celler kunne etterpå aspireres og hentes fra vevet og ytterligere utvidet in vitro¹³. Selv om en studie fra 2020 av Weber et al. demonstrerte WJs gjennomførbarhet og anvendbarhet for å levere fotavtrykkfrie kardiomyocytter inn i myokardiet¹⁴, må den tas i betraktning at WJ-teknologien fortsatt er i et prototypestadium.

Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør og merker porcin fettvevsavledede stromalceller (pADSC) og hvordan du leverer dem til fangstvæske og kadavervev via WJ-teknologi og Williams cystoskopinåler (WN). Post cellulær injeksjon vurderes cellulær vitalitet og elastisitet via atomkraftmikroskopi (AFM). Via trinnvise instruksjoner gir protokollen en klar og kortfattet tilnærming for å skaffe pålitelige data. Diskusjonsdelen presenterer og beskriver teknikkens store fordeler, begrensninger og fremtidsperspektiver. WJ-leveransen av celler samt oppfølgeren postoversettelsesanalyser rapportert her erstatter standard nåleinjeksjon og gir et solid celleleveringsrammeverk for regenerativ helbredelse av målvevet. I våre nylige studier ga vi bevis for at WJ leverte celler mer presist og i det minste i sammenlignbar levedyktighet sammenlignet med nåleinjeksjoner^15,16.

Protocol

Porcine fettvevsprøvene ble hentet fra Institutt for eksperimentell kirurgi ved Universitetet i Tuebingen. Alle prosedyrer ble godkjent av lokale dyrevelferdsmyndigheter under dyreforsøksnummer CU1/16. 1. Isolering av svine fettvevsavledede stromalceller Bruk porcin fettvev levert fra Institutt for eksperimentell kirurgi i et 50 ml sentrifugerør til laboratoriet. Overfør vevet til en steril Petri-tallerken under den sterile benken og hakk det med to ska…

Representative Results

Etter cellelevering via de to tilnærmingene var levedyktigheten til celler levert gjennom WN (97,2 ± 2 %, n=10, p<0,002) høyere sammenlignet med injeksjoner av WJ ved hjelp av E60-10-innstillingene (85,9 ± 0,16 %, n=12) (figur 2). Biomekaniske vurderingsresultater viste at: WN-injeksjoner av celler i fangstvæske viste ingen signifikant forskjell med hensyn til elastisk moduli (EM; 0,992 kPa) sammenlignet med kontrollene (1,176 kPa; figur 3A), mens WJ-injeks…

Discussion

I den nåværende studien demonstrerte og presenterte vi en trinnvis tilnærming for WJ-celleleveringsprosedyren og brukte en oppfølger av kvantitative undersøkelser for å vurdere effekten av WJ-levering på cellulære egenskaper: cellulær levedyktighet og biomekaniske egenskaper (dvs. EM). Etter WJ-injeksjon var 85,9% av de høstede cellene levedyktige. Når det gjelder WN-injeksjon, beholdt 97,2% av cellene sin levedyktighet etter injeksjon. Dermed oppfyller WJ-tilnærmingen et absolutt krav til en klinisk implemen…

Materials

50 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	227261
1 mL BD Luer-LokTM Syringe	BD Plastik Inc	n.a.
100 µm cell sieve	Greiner BioOne	542000
15 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	188271
75 cm2 tissue culture flask	Corning Incorporated	353136
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
AFM processing software	Bruker	JPK00518
AFM software	Bruker	JPK00518
AFM system Cell Hesion 200	Bruker	JPK00518
All-In-One-Al cantilever	Budget Sensors	AIO-10	tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm)
Amphotericin B solution	Sigma	A2942	250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
BD Microlance 3 18G	BD	304622
bovine serum albumin	Gibco	A10008-01
Cantilever	All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10	tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometer	NanoEnTek	631-1098
centrifuge: Rotina 420R	Hettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose	Sigma	D5546
Feather disposable scalpel (No. 10)	Feather	02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
HEPES sodium salt solution (1 M)	Sigma	H3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
laboratory bags	Brand	759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine	Merck	F1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
L-glutamine	Lonza	BE 17-605C1	200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	L3224	Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6	Zeiss
Microscope: AxioVertA.1	Zeiss
Nelaton-Catheter female	Bicakcilar	19512051
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFM	Bruker	T-05-0117
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22	IBM
Sterile Petri dish – CellStar	Greiner BioOne	664160
Tissue culture dishes	TPP AG	TPP93040
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl	Lonza	17-942E
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
Waterjet: ERBEJET2 device	Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection Needle	Cook Medical	G14220	23G, 5.0 Fr, 35 cm