Injeção de células de stroma derivadas de tecido adiposo porcina através da tecnologia waterjet
Summary
Apresentamos um método de injeção celular através da tecnologia de jato de água livre de agulhas, juntamente com uma sequência de investigações pós-entrega em termos de viabilidade celular, proliferação e medidas de elasticidade.
Abstract
A incontinência urinária (UI) é uma condição altamente prevalente caracterizada pela deficiência do músculo esfíncter uretral. Os ramos da medicina regenerativa, particularmente a terapia celular, são novas abordagens para melhorar e restaurar a função de esfíncter uretral. Embora a injeção de células funcionais ativas seja realizada rotineiramente em ambientes clínicos por agulha e seringa, essas abordagens têm desvantagens e limitações significativas. Neste contexto, a tecnologia de jato d’água livre de agulhas (WJ) é um método viável e inovador que pode injetar células viáveis por cistoscopia guiada visual no esfíncter uretrais. No presente estudo, utilizamos o WJ para fornecer células estromais derivadas do tecido adiposo porcina (pADSCs) em tecido uretral cadavérico e, posteriormente, investigamos o efeito da entrega de WJ no rendimento e viabilidade celular. Também avaliamos as características biomecânicas (ou seja, elasticidade) por medições de microscopia de força atômica (AFM). Mostramos que o WJ entregou pADSCs foram significativamente reduzidos em sua elasticidade celular. A viabilidade foi significativamente menor em relação aos controles, mas ainda está acima de 80%.
Introduction
A incontinência urinária (UI) é uma doença generalizada com prevalência de 1,8 – 30,5% nas populações europeias1 e caracteriza-se principalmente pelo mau funcionamento do esfíncter uretral. Do ponto de vista clínico, o tratamento cirúrgico é frequentemente oferecido aos pacientes quando terapias conservadoras ou fisioterapia não conseguem abordar e aliviar os sintomas emergentes.
A terapia celular para o potencial reparo regenerativo do mau funcionamento do complexo esfíncter vem surgindo como uma abordagem vanguardista para o tratamento da patologia da interfacedo usuário 2,3. Seus principais objetivos são substituir, reparar e restaurar a funcionalidade biológica do tecido danificado. Em modelos animais para interface do usuário, o transplante de células-tronco tem mostrado resultados promissores em desfechos uroddinâmicos 2,4,5. As células-tronco surgem como candidatos celulares ideais, pois têm a capacidade de se submeter à autoconexão e diferenciação multipotente, auxiliando assim a regeneração tecidual afetada6. Apesar do próximo potencial regenerativo, o uso prático da terapia celular permanece dificultado, pois o parto minimamente invasivo das células ainda enfrenta vários desafios em relação à precisão da injeção e à cobertura do alvo. Embora a abordagem atual usada para o parto celular seja a injeção através de um sistema de seringaagulha 7, geralmente resulta em um déficit geral de células viáveis, com viabilidades relatadas tão baixas quanto 1%- 31% pós-transplante8. Além disso, a entrega de células por injeção de agulha também tem sido demonstrada para afetar a colocação, a taxa de retenção, bem como a distribuição de células transplantadas no tecido alvo 9,10,11. Uma abordagem viável e nova que supera a limitação acima mencionada é a entrega de células livres de agulhas através da tecnologia de jatos d’água.
A tecnologia waterjet (WJ) está emergindo como uma nova abordagem que permite a entrega de alta throughput de células por cistoscópio sob controle visual no esfíncter uretral12,13. O WJ permite a entrega de células em diferentes pressões (E = efeitos na barra) que variam de E5 a E8013. Na primeira fase, a solução isotônica (fase de penetração tecidual) é aplicada com alta pressão (ou seja, E60 ou E80) a fim de afrouxar a matriz extracelular em torno do tecido direcionado e abrir pequenas micro-lacunas interligadas. Na segunda fase (fase de injeção), a pressão é reduzida dentro de milissegundos (ou seja, até E10) a fim de entregar suavemente as células no tecido alvo. Após esta aplicação em fase de duas etapas, as células não são submetidas a pressão adicional contra o tecido quando ejetadas, mas estão flutuando em um fluxo de baixa pressão em uma área cavernosa cheia de líquido13. Em uma configuração modelo ex vivo onde as células-tronco foram injetadas via WJ em tecido uretra cadavérico, as células viáveis poderiam ser posteriormente aspiradas e recuperadas do tecido e expandidas in vitro13. Embora um estudo de 2020 da Weber et al. tenha demonstrado a viabilidade e aplicabilidade do WJ para fornecer cardiomiócitos sem pegada no miocárdio14, é preciso ter em mente que a tecnologia WJ ainda está em fase de protótipo.
O protocolo a seguir descreve como preparar e rotular células estromais derivadas de tecido suíno (pADSC) e como entregá-las em tecido fluido de captura e cadavérico através da tecnologia WJ e agulhas de cistoscopia williams (WN). A injeção pós-celular, a vitalidade celular e a elasticidade via microscopia de força atômica (AFM) são avaliadas. Por meio de instruções passo a passo, o protocolo oferece uma abordagem clara e concisa para adquirir dados confiáveis. A seção de discussão apresenta e descreve as principais vantagens, limitações e perspectivas futuras da técnica. A entrega de células wj, bem como as análises de pós-tradução sequela relatadas aqui estão substituindo a injeção padrão da agulha e fornecem uma estrutura de entrega de células sólidas para cicatrização regenerativa do tecido alvo. Em nossos estudos recentes, fornecemos evidências de que o WJ forneceu células com mais precisão e pelo menos viabilidade comparável quando comparadas às injeções de agulha15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente estudo, demonstramos e apresentamos uma abordagem passo a passo para o procedimento de entrega de células WJ e empregamos uma sequência de investigações quantitativas para avaliar o efeito da entrega de WJ em características celulares: viabilidade celular e características biomecânicas (ou seja, EM). Após a injeção de WJ, 85,9% das células colhidas eram viáveis. Em termos de injeção de WN, 97,2% das células mantiveram sua viabilidade após a injeção. Assim, a abordagem do WJ preenche um requi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos nossos coautores das publicações originais pela ajuda e apoio.
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
