Мы представляем метод инъекции клеток с помощью безигольчатой водоструйной технологии в сочетании с продолжением послеродовых исследований с точки зрения измерения клеточной жизнеспособности, пролиферации и эластичности.
Недержание мочи (UI) является широко распространенным состоянием, характеризующимся дефицитом мышцы уретрального сфинктера. Отрасли регенеративной медицины, особенно клеточная терапия, являются новыми подходами к улучшению и восстановлению функции уретрального сфинктера. Несмотря на то, что инъекция активных функциональных клеток обычно выполняется в клинических условиях с помощью иглы и шприца, эти подходы имеют значительные недостатки и ограничения. В этом контексте технология безигольчатой гидроабразивной струи (WJ) является осуществимым и инновационным методом, который может вводить жизнеспособные клетки с помощью визуальной цистоскопии в уретральный сфинктер. В настоящем исследовании мы использовали WJ для доставки стромальных клеток (pADSC), полученных из жировой ткани свиней, в трупную уретральную ткань и впоследствии исследовали влияние доставки WJ на выход и жизнеспособность клеток. Мы также оценили биомеханические характеристики (т.е. эластичность) с помощью измерений атомно-силовой микроскопии (AFM). Мы показали, что pADSC, доставленные WJ, были значительно снижены в их клеточной эластичности. Жизнеспособность была значительно ниже по сравнению с контрольной группой, но все еще выше 80%.
Недержание мочи (UI) является широко распространенным расстройством с распространенностью 1,8 – 30,5% в европейских популяциях1 и характеризуется в первую очередь неисправностью уретрального сфинктера. С клинической точки зрения хирургическое лечение часто предлагается пациентам, когда консервативная терапия или физиотерапия не могут решить и облегчить возникающие симптомы.
Клеточная терапия потенциальной регенеративной репарации сфинктерного комплекса возникает как авангардный подход к лечению патологииUI 2,3. Его основными целями являются замена, восстановление и восстановление биологической функциональности поврежденной ткани. На животных моделях для пользовательского интерфейса трансплантация стволовых клеток показала многообещающие результаты в уродинамических исходах 2,4,5. Стволовые клетки возникают как оптимальные клеточные кандидаты, поскольку они обладают способностью подвергаться самообновлению и мультипотентной дифференцировке, таким образом, способствуя регенерации пораженной ткани6. Несмотря на предстоящий регенеративный потенциал, практическое использование клеточной терапии остается затрудненным, поскольку минимально инвазивная доставка клеток по-прежнему сталкивается с рядом проблем, касающихся точности инъекций и охвата мишени. Несмотря на то, что текущий подход, используемый для доставки клеток, представляет собой инъекцию через систему иглы-шприца7, он обычно приводит к общему дефициту жизнеспособных клеток, при этом заявленные жизнеспособности составляют всего 1%-31% после трансплантации8. Кроме того, было также показано, что доставка клеток с помощью инъекции иглы влияет на размещение, скорость удержания, а также на распределение трансплантированных клеток в целевой ткани 9,10,11. Осуществимым, новым подходом, который преодолевает вышеупомянутое ограничение, является доставка клеток без игл с помощью водоструйной технологии.
Технология Waterjet (WJ) становится новым подходом, который обеспечивает высокую пропускную способность доставки клеток цистоскопом под визуальным контролем в уретральном сфинктере12,13. WJ обеспечивает доставку ячеек при различных давлениях (E = эффекты в барах) в диапазоне от E5 до E8013. В первой фазе (фазе проникновения в ткани) изотонический раствор наносят с высоким давлением (т.е. Е60 или Е80) с целью ослабления внеклеточного матрикса, окружающего ткани-мишень, и открытия небольших соединительных микролакунов. Во второй фазе (фазе инъекции) давление понижается в течение миллисекунд (т.е. до Е10), чтобы мягко доставить клетки в ткани-мишени. После этого двухэтапного применения клетки не подвергаются дополнительному давлению на ткань при выбросе, а плавают в потоке низкого давления в заполненную жидкостью кавернозную область13. В условиях модели ex vivo, где стволовые клетки вводились через WJ в трупную ткань уретры, жизнеспособные клетки могли быть впоследствии аспирированы и извлечены из ткани и дополнительно расширены in vitro13. Хотя исследование 2020 года Weber et al. продемонстрировало осуществимость и применимость WJ для доставки кардиомиоцитов без следов в миокард14, следует иметь в виду, что технология WJ все еще находится на стадии прототипа.
Следующий протокол описывает, как подготовить и маркировать стромальные клетки, полученные из жировой ткани свиней (pADSC), и как доставить их в улавливающую жидкость и трупную ткань с помощью технологии WJ и игл цистоскопии Уильямса (WN). После клеточной инъекции оценивается клеточная жизнеспособность и эластичность с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Посредством пошаговых инструкций протокол дает четкий и лаконичный подход к получению достоверных данных. В дискуссионном разделе представлены и описаны основные преимущества, ограничения и будущие перспективы методики. Доставка WJ клеток, а также анализы sequela post translation, о которых сообщается здесь, заменяют стандартную инъекцию иглы и обеспечивают прочную основу для доставки клеток для регенеративного заживления ткани-мишени. В наших недавних исследованиях мы предоставили доказательства того, что WJ доставлял клетки более точно и, по крайней мере, с сопоставимой жизнеспособностью по сравнению с инъекциями иглы15,16.
В настоящем исследовании мы продемонстрировали и представили пошаговый подход к процедуре доставки WJ-клеток и использовали продолжение количественных исследований для оценки влияния доставки WJ на клеточные характеристики: жизнеспособность клеток и биомеханические особенности (т.е….
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим наших соавторов из оригинальных публикаций за помощь и поддержку.
50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
AFM software | Bruker | JPK00518 | |
AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
laboratory bags | Brand | 759705 | |
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |