Inyección de células del estroma derivadas del tejido adiposo porcino a través de la tecnología de chorro de agua
Summary
Presentamos un método de inyección celular a través de la tecnología de chorro de agua sin aguja junto con una secuela de investigaciones posteriores a la entrega en términos de mediciones de viabilidad celular, proliferación y elasticidad.
Abstract
La incontinencia urinaria (IU) es una afección altamente prevalente caracterizada por la deficiencia del músculo del esfínter uretral. Las ramas de la medicina regenerativa, particularmente la terapia celular, son enfoques novedosos para mejorar y restaurar la función del esfínter uretral. A pesar de que la inyección de células funcionales activas se realiza rutinariamente en entornos clínicos con aguja y jeringa, estos enfoques tienen desventajas y limitaciones significativas. En este contexto, la tecnología de chorro de agua sin aguja (WJ) es un método factible e innovador que puede inyectar células viables mediante cistoscopia guiada visualmente en el esfínter uretral. En el presente estudio, utilizamos WJ para administrar células estromales derivadas del tejido adiposo porcino (pADSC) en el tejido uretral cadavérico y posteriormente investigamos el efecto de la entrega de WJ sobre el rendimiento y la viabilidad celular. También evaluamos las características biomecánicas (es decir, la elasticidad) mediante mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM). Demostramos que las pADSC administradas por WJ se redujeron significativamente en su elasticidad celular. La viabilidad fue significativamente menor en comparación con los controles, pero todavía está por encima del 80%.
Introduction
La incontinencia urinaria (IU) es un trastorno generalizado con una prevalencia del 1,8 al 30,5% en las poblaciones europeas1 y se caracteriza principalmente por el mal funcionamiento del esfínter uretral. Desde una perspectiva clínica, el tratamiento quirúrgico a menudo se ofrece a los pacientes cuando las terapias conservadoras o la fisioterapia no abordan y alivian los síntomas emergentes.
La terapia celular para la potencial reparación regenerativa del mal funcionamiento del complejo del esfínter ha ido emergiendo como un enfoque vanguardista para el tratamiento de la patología de la IU 2,3. Sus principales objetivos son reemplazar, reparar y restaurar la funcionalidad biológica del tejido dañado. En modelos animales para IU, el trasplante de células madre ha mostrado resultados prometedores en resultados urodinámicos 2,4,5. Las células madre surgen como candidatas celulares óptimas, ya que tienen la capacidad de someterse a la autorrenovación y la diferenciación multipotente, lo que ayuda a la regeneración del tejido afectado6. A pesar del potencial regenerativo que se avecina, el uso práctico de la terapia celular sigue siendo obstaculizado, ya que la administración mínimamente invasiva de células aún enfrenta varios desafíos relacionados con la precisión de la inyección y la cobertura del objetivo. A pesar de que el enfoque actual utilizado para la administración de células es la inyección a través de un sistema de aguja-jeringa7, generalmente resulta en un déficit general de células viables, con viabilidades reportadas tan bajas como 1% – 31% después del trasplante8. Además, también se ha demostrado que la administración de células a través de la inyección con aguja afecta la colocación, la tasa de retención y la distribución de las células trasplantadas en el tejido objetivo 9,10,11. Un enfoque factible y novedoso que supera la limitación mencionada anteriormente es la entrega de células sin agujas a través de la tecnología de chorro de agua.
La tecnología de chorro de agua (WJ) está emergiendo como un nuevo enfoque que permite la entrega de células de alto rendimiento por cistoscopio bajo control visual en el esfínter uretral12,13. El WJ permite la entrega de células a diferentes presiones (E = efectos en bar) que van desde E5 hasta E8013. En la primera fase, (fase de penetración tisular) se aplica solución isotónica con alta presión (es decir, E60 o E80) para aflojar la matriz extracelular que rodea el tejido objetivo y abrir pequeñas microlacuras de interconexión. En la segunda fase (la fase de inyección), la presión se reduce en milisegundos (es decir, hasta E10) para entregar suavemente las células al tejido objetivo. Después de esta aplicación de dos fases escalonadas, las células no se someten a presión adicional contra el tejido cuando se expulsan, sino que flotan en una corriente de baja presión en un área cavernosa llena de líquido13. En un entorno de modelo ex vivo donde las células madre se inyectaron a través de WJ en el tejido de la uretra cadavérica, las células viables podrían aspirarse y recuperarse posteriormente del tejido y expandirse aún más in vitro13. Aunque un estudio de 2020 realizado por Weber et al. demostró la viabilidad y aplicabilidad de WJ para entregar cardiomiocitos sin huella en el miocardio14, debe tenerse en cuenta que la tecnología WJ aún se encuentra en una etapa de prototipo.
El siguiente protocolo describe cómo preparar y etiquetar las células estromales derivadas del tejido adiposo porcino (pADSC) y cómo administrarlas en el líquido de captura y el tejido cadavérico a través de la tecnología WJ y las agujas de cistoscopia Williams (WN). Después de la inyección celular, se evalúa la vitalidad y elasticidad celular a través de la microscopía de fuerza atómica (AFM). A través de instrucciones paso a paso, el protocolo ofrece un enfoque claro y conciso para adquirir datos confiables. La sección de discusión presenta y describe las principales ventajas, limitaciones y perspectivas futuras de la técnica. La entrega de células WJ, así como los análisis posteriores a la traducción de secuelas informados aquí están reemplazando la inyección de aguja estándar y proporcionan un marco de administración de células sólidas para la curación regenerativa del tejido objetivo. En nuestros estudios recientes proporcionamos evidencia de que WJ administró células con mayor precisión y al menos en viabilidad comparable en comparación con las inyecciones con aguja15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente estudio, demostramos y presentamos un enfoque paso a paso para el procedimiento de entrega de células WJ y empleamos una secuela de investigaciones cuantitativas para evaluar el efecto de la entrega de WJ en las características celulares: viabilidad celular y características biomecánicas (es decir, EM). Después de la inyección de WJ, el 85,9% de las células cosechadas eran viables. En términos de inyección de WN, el 97,2% de las células conservaron su viabilidad después de la inyección. Por lo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros coautores de las publicaciones originales por su ayuda y apoyo.
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
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