Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации Caenorhabditis elegans
Summary
Протокол описывает простую микрофлюидную конструкцию чипа и методологию микрофабрикации, используемую для выращивания C. elegans в присутствии непрерывного питания в течение 36 ч. Устройство для роста и визуализации также обеспечивает прерывистую долгосрочную визуализацию клеточных и субклеточных процессов с высоким разрешением в течение нескольких дней.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) оказался ценной модельной системой для изучения биологических процессов развития и клеток. Понимание этих биологических процессов часто требует длительной и повторной визуализации одного и того же животного. Длительное время восстановления, связанное с обычными методами иммобилизации, выполняемыми на агаровых прокладках, оказывает пагубное влияние на здоровье животных, что делает неуместным повторное изображение одного и того же животного в течение длительных периодов времени. В этой статье описывается конструкция микрофлюидного чипа, метод изготовления, протокол культивирования C. elegans на чипе и три примера долгосрочной визуализации для изучения процессов развития у отдельных животных. Чип, изготовленный из полидиметилсилоксана и склеенный на покровном стекле, обездвиживает животных на стеклянной подложке с помощью эластомерной мембраны, которая отклоняется с помощью газообразного азота. Полная иммобилизация C. elegans обеспечивает надежную покадровую визуализацию клеточных и субклеточных событий без анестезии. Геометрия канала с большим поперечным сечением позволяет животному свободно перемещаться в пределах двух частично герметичных изоляционных мембран, позволяющих расти в канале с непрерывной подачей пищи. Используя этот простой чип, можно выполнить визуализацию явлений развития, таких как рост нейронного процесса, развитие вульвы и дендритная арборизация в сенсорных нейронах PVD, когда животное растет внутри канала. Долговременный чип роста и визуализации работает с одной линией давления, без внешних клапанов, недорогими жидкими расходными материалами и использует стандартные протоколы обработки червей, которые могут быть легко адаптированы другими лабораториями с использованием C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans оказался мощным модельным организмом для изучения клеточной биологии, старения, биологии развития и нейробиологии. Такие преимущества, как прозрачное тело, короткий жизненный цикл, простота обслуживания, определенное количество клеток, гомология с несколькими человеческими генами и хорошо изученная генетика, привели к тому, что C. elegans стал популярной моделью как для открытий фундаментальной биологии, так и для прикладных исследований 1,2. Понимание биологических и эволюционных процессов клетки из повторяющихся долгосрочных наблюдений за отдельными животными может оказаться полезным. Условно C. elegans обезболивают на агаровых подушечках и визуализируют под микроскопом. Неблагоприятное воздействие анестетиков на здоровье животных ограничивают применение анестезируемых животных для длительной и повторной прерывистой визуализации одного и того же животного 3,4. Последние достижения в области микрофлюидных технологий и их адаптация к безанестезному отлову C. elegans с незначительной опасностью для здоровья позволяют получать изображения одного и того же животного с высоким разрешением в течение короткого и длительного периода времени.
Микрофлюидные чипы были разработаны для высокопроизводительного скрининга C. elegans’5 6,7,8, улавливания и дозирования 9, скрининга лекарств10,11, стимуляции нейронов с помощью визуализации высокого разрешения12 и визуализации животного с высоким разрешением 12,13,14. Также разработаны ультратонкие микрофлюидные листы для иммобилизации на слайдах15. Долгосрочные исследования C. elegans были выполнены с использованием изображений животных с низким разрешением, растущих в жидкой культуре, для наблюдения за ростом, динамикой кальция, влиянием лекарств на их поведение 16,17,18,19, их долголетием и старением 20. Долгосрочные исследования с использованием микроскопии высокого разрешения были проведены для оценки синаптического развития21, регенерации нейронов22 и митохондриального добавления23. Долгосрочная визуализация высокого разрешения и отслеживание судьбы и дифференцировки клеток были выполнены в многоканальных устройствах24,25. Несколько клеточных и субклеточных событий происходят в течение нескольких часов и требуют захвата одного и того же человека в разные моменты времени во время их развития, чтобы охарактеризовать все промежуточные этапы процесса для понимания клеточной динамики in vivo. Чтобы изобразить биологический процесс, такой как органогенез, развитие нейронов и миграция клеток, животное должно быть обездвижено в одной и той же ориентации в нескольких точках времени. Ранее мы опубликовали протокол для визуализации C. elegans с высоким разрешением в течение более 36 ч, чтобы определить, где митохондрии добавляются вдоль нейронов сенсорных рецепторов (TRNs)23.
В этой статье представлен протокол для создания методологии на основе микрофлюидики для повторного изображения с высоким разрешением. Это устройство с одним каналом потока лучше всего подходит для повторной визуализации одного животного на устройство. Чтобы улучшить пропускную способность и изображение многих животных одновременно, несколько устройств могут быть подключены к одной и той же линии давления, но с отдельными трехсторонними разъемами, управляющими одним животным в каждом устройстве. Дизайн полезен для исследований, которые требуют покадровых изображений с высоким разрешением, таких как постэмбриональные процессы развития, миграция клеток, транспорт органелл, исследования экспрессии генов и т. Д. Технология может быть ограниченной для некоторых применений, таких как исследования продолжительности жизни и старения, которые требуют параллельного роста и визуализации многих животных на поздней стадии. Для изготовления этого устройства использовался эластомер полидиметилсилоксана (PDMS) из-за его биостабильности26, биосовместимости 27,28, газопроницаемости 29,30 и перестраиваемого модуля упругости31. Это двухслойное устройство позволяет выращивать животных с непрерывной подачей пищи в микрофлюидном канале и улавливать отдельных C. elegans через мембранное сжатие PDMS с использованием газообразного азота. Это устройство является расширением ранее опубликованного устройства с преимуществом выращивания и визуализации одного и того же животного в микроканале под непрерывной подачей пищи3. Дополнительная изоляционная мембранная сеть и улавливающая мембрана шириной 2 мм обеспечивают эффективную иммобилизацию развивающихся животных. Устройство использовалось для наблюдения за развитием нейронов, развитием вульвы и дендритной арборизацией в сенсорных нейронах PVD. Животные растут без неблагоприятных последствий для здоровья в устройстве и могут быть многократно обездвижены, чтобы облегчить визуализацию субклеточных событий у одного и того же животного во время его развития.
Весь протокол разделен на пять частей. Часть 1 описывает изготовление устройства для чипа роста и визуализации. В части 2 описывается, как настроить систему давления для отклонения мембраны PDMS для иммобилизации и изоляции отдельных C. elegans. Часть 3 описывает, как синхронизировать C. elegans на пластине среды роста нематод (NGM) для визуализации устройства. Часть 4 описывает, как загрузить одно животное в устройство и вырастить животное внутри микрофлюидного устройства в течение нескольких дней. Часть 5 описывает, как обездвижить отдельное животное в нескольких точках времени, захватить изображения с высоким разрешением с использованием различных целей и проанализировать изображения с помощью Фиджи.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе описан протокол изготовления и использования простого микрофлюидного устройства для выращивания C. elegans с постоянным питанием и визуализацией высокого разрешения одного животного во время его развития. Этот процесс изготовления прост и может быть выполнен в несте…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим центр визуализации CIFF, NCBS за использование конфокальных микроскопов, поддерживаемых DST – Центром нанотехнологий (No. SR/55/NM-36-2005). Мы благодарим финансирование исследований от DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), вращающийся диск при поддержке DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK и Gautam Menon) и грант HHMI-IECS номер 55007425 (SPK). Штаммы HB101, PS3239 и wdIs51 были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). S.P.K. сделал jsIs609 в лаборатории Майка Нонета.
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
References
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
- Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
- Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
- Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
- Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
- Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
- Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
- Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
- Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
- Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. 발생학. 345 (1), 18-33 (2010).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
- Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
- Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
- Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
- Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
- Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).
