DetectSyn: En rask, objektiv fluorescerende metode for å oppdage endringer i synapsetetthet

Summary

DetectSyn er en objektiv, rask fluorescerende analyse som måler endringer i relativ synapse (pre- og postsynaptisk engasjement) antall på tvers av behandlinger eller sykdomstilstander. Denne teknikken benytter en nærhet ligation teknikk som kan brukes både i dyrkede nevroner og fast vev.

Abstract

Synapser er stedet for kommunikasjon mellom nevroner. Nevronal kretsstyrke er relatert til synaptisk tetthet, og nedbrytningen av synapser er karakteristisk for sykdomstilstander som stor depressiv lidelse (MDD) og Alzheimers sykdom. Tradisjonelle teknikker for å undersøke synapsetall inkluderer genetisk uttrykk for fluorescerende markører (f.eks. grønt fluorescerende protein (GFP)), fargestoffer som fyller et nevron (f.eks. karbocyaninfarge, DiI) og immunfluorescerende deteksjon av ryggmarkører (f.eks. postsynaptisk tetthet 95 (PSD95)). En stor advarsel til disse proxy-teknikkene er at de bare identifiserer postsynaptiske endringer. Likevel er en synapse en forbindelse mellom en presynaptisk terminal og en postsynaptisk ryggrad. Gullstandarden for måling av synapsedannelse/eliminering krever tidkrevende elektronmikroskopi eller matrisetomografiteknikker. Disse teknikkene krever spesialisert opplæring og kostbart utstyr. Videre kan bare et begrenset antall nevroner vurderes og brukes til å representere endringer i en hel hjerneregion. DetectSyn er en rask fluorescerende teknikk som identifiserer endringer i synapsedannelse eller eliminering på grunn av en sykdomstilstand eller narkotikaaktivitet. DetectSyn benytter en rask nærhetsligasjonsanalyse for å oppdage sammenstilte pre- og postsynaptiske proteiner og standard fluorescerende mikroskopi, en teknikk som er lett tilgjengelig for de fleste laboratorier. Fluorescerende deteksjon av den resulterende puncta gir rask og objektiv analyse av eksperimenter. DetectSyn gir mer representative resultater enn elektronmikroskopi fordi større områder kan analyseres enn et begrenset antall fluorescerende nevroner. Videre fungerer DetectSyn for in vitro-dyrkede nevroner og faste vevsskiver. Til slutt er det gitt en metode for å analysere dataene som samles inn fra denne teknikken. Totalt sett tilbyr DetectSyn en prosedyre for å oppdage relative endringer i synapsetetthet på tvers av behandlinger eller sykdomstilstander og er mer tilgjengelig enn tradisjonelle teknikker.

Introduction

Synapser er den grunnleggende kommunikasjonsenheten mellom nevroner¹. Mange synapser mellom nevroner i de samme regionene gir opphav til kretser som formidler atferd². Synapser består av en presynaptisk terminal fra en nevron som frigjør nevrotransmittere eller nevropeptider som videresender informasjon til postsynaptiske reseptorer av en annen nevron. Oppsummeringen av presynaptiske signaler bestemmer om den postsynaptiske nevronen vil avfyre et handlingspotensial og forplante meldingen til andre nevroner.

Synaptopatologi, nedbrudd av synapser, oppstår i sykdommer og lidelser preget av redusert nevralt volum, som Alzheimers sykdom og stor depressiv lidelse, noe som resulterer i kretser som ikke lenger optimalt utfører ^3,4,5. Gjenoppretting av synapsetetthet ligger sannsynligvis til grunn for effekten av potensielle behandlinger for disse lidelsene. For eksempel ble det nylig demonstrert at økende synapser ligger til grunn for atferdseffekten av raske antidepressiva⁶. For raskt å screene mulige synaptopatologibehandlinger, krever forskere teknikker som raskt identifiserer endringer i synapsetall.

Nåværende metoder er enten tidkrevende og dyre (elektronmikroskopi, matrisetomografi), eller de undersøker bare postsynaptiske endringer uten å inkorporere presynaptisk engasjement (rygganalyser, immunfluorescens/colokalisering). Fargestoffer som DiI eller fluorescerende proteiner som GFP bidrar til å visualisere nevroner og karakterisere postsynaptiske spines. Ryggradsanalysen bruker imidlertid forskerdefinerte forhold for å bestemme morfologi, noe som kan redusere reproduserbarheten⁷. Videre blir det fortsatt avdekket hvordan de forskjellige ryggradsklassene forholder seg til funksjonelle synapser^. Ryggradsdannelse kan være forbigående og kan reflektere postsynaptisk plastisitet, men disse ryggradene kan elimineres før de stabiliseres til en synapse med en presynaptisk nevron⁹.

Colocalization gir en bedre proxy for synapser enn ryggradsanalyse fordi man kan immunostain for presynaptiske og postsynaptiske proteiner. Synaptiske proteiner kan imidlertid gi lave colokaliseringsverdier fordi proteinene er sammenstilt og kanskje ikke overlapper konsekvent. Således, fordi proteinene ikke er helt overliggende, kan colokaliseringsteknikker ikke nøyaktig måle endringer i synapsedannelse på grunn av denne manglende informasjonen. Til slutt, selv om både elektronmikroskopi (EM) og matrisetomografi gir høyoppløselige bilder av synapser, er de tidkrevende. EM krever videre spesialisert utstyr, og forskere er begrenset til små mengder vev for et gitt eksperiment. Mens matrisetomografi elegant gir muligheten til å screene for mange proteiner på ultratynne seksjoner og kan kombineres med EM¹⁰, kan denne teknikken være for arbeidskrevende og utenfor omfanget av eksperimenter som må skannes raskt for endringer i synapsedannelse.

DetectSyn er en spesifikk anvendelse av Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen muliggjør generell påvisning av proteinproteininteraksjoner. DetectSyn bridges proxy postsynaptiske tiltak ved å forsterke et fluorescerende signal som slippes ut av taggede pre- og postsynaptiske proteiner innen 40 nm fra hverandre. Hvis de synaptiske proteinene er innenfor 40 nm, som innenfor en synaptisk kløft, vil de sekundære antistoffene, som inneholder DNA-sonder, hybridisere til sirkulært DNA. Dette hybridiserte sirkulære DNA-et uttrykker en fluorescerende sonde, som deretter forsterkes og oppdages med standard fluorescerende mikroskopiteknikker (se figur 1). Avgjørende, i motsetning til EM og matrisetomografi, krever denne teknikken ikke spesialisert utstyr og tar omtrent samme tid som standard immunhiistokjemi. Tilgjengeligheten av denne teknikken gjør det dermed mulig for etterforskere utenfor forskningsintensive institusjoner å delta i synaptopatologiforskning. Videre kan denne teknikken undersøke endringer i synaptisk tetthet i flere hjerneregioner i et enkelt eksperiment, og tilbyr en mer helhetlig representasjon av synaptiske endringer på grunn av sykdom eller behandling.

Protocol

Isolering av celler og vev fra dyr var i samsvar med National Institutes of Health’s Guide for care and use of Laboratory Animals og godkjent av Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee MERK: Denne protokollen brukes på prøver som allerede er behandlet og fikset i henhold til spesifikke eksperimentelle paradigmer og krav. For demonstrasjonsformål brukes synapsedannelse på grunn av rask antidepressiv behandling til å markere denne synapsedeteksjonsteknikken…

Representative Results

Data modifisert fra Heaney et al.6 presenteres for å demonstrere et eksperiment der økt synapsedannelse forventes (se6 for mer informasjon og en mer grundig diskusjon av mekanismen). Tidligere ble det demonstrert at raske antidepressiva krever aktivering av den hemmende metabotrope reseptoren, GABAB (gamma-aminosmørsyre subtype B), for å være effektiv13. Videre indikerte tidligere data at raske antidepressiva øker postsynaptiske markører<sup c…

Discussion

DetectSyn er en rask analyse som bruker en nærhet ligation analyse for å oppdage proteiner innen 40 nm av hverandre, noe som gjør det mulig å oppdage synapsedannelse. Denne teknikken forbedrer dagens fluorescerende analyser, som bare fungerer som proxy-målinger for synapsedannelse. DetectSyn oppdager kvantifiserbare endringer i synaptiske proteiner lokalisert innen 40 nm, det vil si innenfor synaptisk kløft, av hverandre. Videre er DetectSyn mer kostnadseffektivt og tar mindre tid enn teknikker, som elektronmikrosk…

Materials

10x PBS	Fisher Scientific	BP39920	PBS made in house works, as well.
24 well plates	Fisher Scientific	FB012929	For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Aluminium foil	Fisher Scientific	15-078-290
Chicken anti-MAP2 antibody	Abcam	ab5392
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Other clear nail polish works, as well.
Cold block	Fisher Scientific	13131012
Computer workstation	HP
Confocal or fluorescent microscope	Nikon	A1R HD25
Donkey anti-chicken FITC	Fisher Scientific	SA1-72000
Duolink donkey anti-Mouse PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink donkey anti-Rabbit MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink In Situ Detection Reagents Far Red	Sigma	DUO92013	Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049	Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.
Fine-tipped paintbrush	Fisher Scientific	NC9691026	Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12545MP	Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	1255015	For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.
Freezer, -20°C	VWR	76449-108
Glass coverslips	Fisher Scientific	125480
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Image processing software	e.g. NIS Elements, ImageJ
Incubator	Fisher Scientific	15-015-2633
Large petri dish, 100mm	Fisher Scientific	FB0875712
Molecular grade water	Fisher Scientific	BP24701
Mouse anti-Synapsin1 antibody	Synaptic Systems	106-011
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Orbital shaker	Fisher Scientific	02-106-1013
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Pipette tips	Fisher Scientific	02-707-025
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100	Working volumes range from 3 µL to 500 µL
Plastic pasteur pipette	Fisher Scientific	02-708-006
Precision tweezers/foreceps	Fisher Scientific	12-000-122
Rabbit anti-PSD95 antibody	Abcam	ab18258	Other antibody pairs may work, as well, with optimization.
Refrigerator	VWR	76470-402
Small petri dish, 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100