פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.
הטרוגניות תאית מציבה אתגרים להבנת תפקודן של רקמות מורכבות ברמת שעתוק. שימוש ב-RNA ספציפי לסוג התא מונע מלכודות פוטנציאליות הנגרמות על ידי ההטרוגניות של רקמות ומשחרר את ניתוח השעתוק העוצמתי. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד להשתמש בשיטת טיהור זיקת ריבוזום (TRAP) לבודד רנ”א הקשורים לריבוזום מכמות קטנה של תאים המבטאים EGFP ברקמה מורכבת ללא מיון תאים. פרוטוקול זה מתאים לבידוד רנ”א ספציפיים לסוג התא באמצעות מודל עכבר NuTRAP הזמין לאחרונה, וניתן להשתמש בו גם לבידוד רנ”א מכל תא המבטא EGFP.
גישות בעלות תפוקה גבוהה, כולל ריצוף RNA (RNA-seq) ומיקרו-מערך, אפשרו לחקור פרופילי ביטוי גנים ברמה הגנומית כולה. עבור רקמות מורכבות כמו הלב, המוח והאשכים, הנתונים הספציפיים לסוג התא יספקו פרטים נוספים המשווים את השימוש ב-RNA מכל הרקמה 1,2,3. כדי להתגבר על ההשפעה של הטרוגניות תאית, שיטת טיהור זיקת הריבוזום המתורגמת (TRAP) פותחה מאז תחילת שנות ה-20104. TRAP מסוגל לבודד רנ”א הקשורים לריבוזום מסוגי תאים ספציפיים ללא דיסוציאציה של רקמות. שיטה זו שימשה לניתוח טרנסלטום (mRNA המגויס לריבוזום לתרגום) באורגניזמים שונים, כולל התמקדות באוכלוסייה נדירה ביותר של תאי שריר בעוברי Drosophila5, חקר תאי שורש שונים בצמח המודל Arabidopsis thaliana6, וביצוע ניתוח תעתיק של תאי אנדותל ביונקים7.
TRAP דורש שינוי גנטי כדי לתייג את הריבוזום של אורגניזם מודל. אוון רוזן ועמיתיו פיתחו לאחרונה מודל עכבר בשם תיוג גרעיני ותרגום של עכברטיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) 8, הזמין דרך מעבדת ג’קסון מאז 2017. על ידי חצייה עם קו עכבר Cre, חוקרים יכולים להשתמש במודל עכבר NuTRAP זה כדי לבודד רנ”א הקשורים לריבוזום וגרעיני תאים מתאים המבטאים Cre ללא מיון תאים. בתאים המבטאים Cre הנושאים גם את אלל NuTRAP, הריבוזום המתויג EGFP/L10a מאפשר בידוד של תרגום mRNA באמצעות מבחני משיכה של זיקה. באותו תא, הממברנה הגרעינית המתויגת כפפטיד זיהוי ביוטין ליגאז (BLRP), שגם היא חיובית ל-mCherry, מאפשרת בידוד גרעיני באמצעות טיהור מבוסס זיקה או פלואורסצנציה. אותו צוות מחקר גם יצר קו עכברים דומה שבו קרום הגרעין מסומן רק עם mCherry ללא ביוטין8. שני קווי עכבר מהונדסים גנטית אלה נותנים גישה לאפיין פרופילים אפיגנומיים ותעתיקיים זוגיים של סוגים ספציפיים של תאים בעלי עניין.
מסלול האיתות של הקיפוד (Hh) ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות רקמות9. GLI1, בן למשפחת GLI, פועל כמפעיל תעתוק ומתווך את איתות ה-HH. תאי Gli1+ יכולים להימצא באיברים רבים המפרישים הורמונים, כולל בלוטת יותרת הכליה והאשכים. כדי לבודד דנ”א ו-RNA ספציפיים לסוג התא מתאי Gli1+ באמצעות מודל העכבר NuTRAP, עכברי Gli1-CreERT2 הוצלבו עם עכברי NuTRAP. עכברי Shh-CreERT2 נחצו גם הם כאשר עכברי NuTRAP נועדו לבודד תאים המבטאים קיפוד קולי (Shh). הפרוטוקול הבא מראה כיצד להשתמש ב– Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP לבידוד רנ”א הקשורים לריבוזום מתאי Gli1+ באשכים של עכברים בוגרים.
התועלת של ניתוח תעתיק רקמה שלמה יכולה להיות מעומעמת, במיוחד כאשר חוקרים רקמות הטרוגניות מורכבות. כיצד להשיג רנ”א ספציפי לסוג התא הופך לצורך דחוף לשחרר את טכניקת ה-RNA-seq רבת העוצמה. הבידוד של רנ”א ספציפיים לסוג התא מסתמך בדרך כלל על איסוף של סוג מסוים של תאים באמצעות מיקרומניפולציה, מיון תאים …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי NIH R00HD082686. אנו מודים למלגת מחקר הקיץ של החברה האנדוקרינית ל- H.S.Z. אנו מודים גם לד”ר יואן קאנג על הרבייה והשמירה על מושבת העכברים.
Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
GFP antibody | Abcam | ab290 | |
Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
KCl | Biosciences | R005 | |
MgCl2 | Biosciences | R004 | |
Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
Tris | Alfa Aesar | J62848 |