Isoler celletypespesifikke RNAer fra snapfrosne heterogene vevsprøver uten cellesortering
Summary
Denne protokollen tar sikte på å isolere celletypespesifikke oversette ribosomale mRNA ved hjelp av NuTRAP-musemodellen.
Abstract
Cellulær heterogenitet gir utfordringer for å forstå funksjonen til komplekse vev på transkriptomnivå. Ved å bruke celletypespesifikke RNA unngår potensielle fallgruver forårsaket av heterogeniteten til vev og frigjør den kraftige transkriptomanalysen. Protokollen beskrevet her demonstrerer hvordan du bruker TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) for å isolere ribosombundne RNA fra en liten mengde EGFP-uttrykkende celler i et komplekst vev uten cellesortering. Denne protokollen er egnet for å isolere celletypespesifikke RNAer ved hjelp av den nylig tilgjengelige NuTRAP-musemodellen , og kan også brukes til å isolere RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.
Introduction
High-throughput-tilnærminger, inkludert RNA-sekvensering (RNA-seq) og mikroarray, har gjort det mulig å forhøre genuttrykksprofiler på genomnivå. For komplekse vev som hjerte, hjerne og testis, vil de celletypespesifikke dataene gi flere detaljer som sammenligner bruken av RNA fra hele vevet 1,2,3. For å overvinne virkningen av cellulær heterogenitet, har TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) blitt utviklet siden tidlig på 2010-tallet4. TRAP er i stand til å isolere ribosombundne RNA fra spesifikke celletyper uten vevsdissosiasjon. Denne metoden har blitt brukt til translatomanalyse (mRNA som rekrutteres til ribosomet for oversettelse) i forskjellige organismer, inkludert målretting mot en ekstremt sjelden populasjon av muskelceller i Drosophila-embryoer5, studere forskjellige rotceller i modellplanten Arabidopsis thaliana6, og utføre transkriptomanalyse av endotelceller hos pattedyr7.
TRAP krever en genetisk modifisering for å merke ribosomet til en modellorganisme. Evan Rosen og kolleger utviklet nylig en musemodell kalt Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har vært tilgjengelig gjennom Jackson Laboratory siden 2017. Ved å krysse med en Cre-muselinje, kan forskere bruke denne NuTRAP-musemodellen til å isolere ribosombundne RNAer og cellekjerner fra Cre-uttrykkende celler uten cellesortering. I Cre-uttrykkende celler som også bærer NuTRAP-allelet , tillater EGFP / L10a-merket ribosom isolering av oversettelse av mRNA ved hjelp av affinitetsnedtrekksanalyser. I samme celle tillater biotinligasegjenkjenningspeptidet (BLRP) -merket nukleær membran, som også er mCherry-positiv, den kjernefysiske isolasjonen ved å bruke affinitets- eller fluorescensbasert rensing. Det samme forskerteamet genererte også en lignende muselinje der kjernemembranen bare er merket med mCherry uten biotin8. Disse to genmodifiserte muselinjene gir tilgang til å karakterisere parrede epigenomiske og transkriptomiske profiler av spesifikke typer celler i interesse.
Pinnsvinet (Hh) signalveien spiller en kritisk rolle i vevsutvikling9. GLI1, et medlem av GLI-familien, fungerer som en transkripsjonsaktivator og formidler Hh-signalering. Gli1+-celler finnes i mange hormonutskillende organer, inkludert binyrene og testisene. For å isolere celletypespesifikke DNAer og RNA fra Gli1+-celler ved hjelp av NuTRAP-musemodellen, ble Gli1-CreERT2-mus krysset med NuTRAP-musene. Shh-CreERT2-mus ble også krysset med NuTRAP-musene som mål å isolere sonisk pinnsvin (Shh) som uttrykker celler. Følgende protokoll viser hvordan du bruker Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus for å isolere ribosombundne RNA fra Gli1+-celler i voksne musetester.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nytten av helvevstranskriptomanalysen kan dempes, spesielt når man studerer komplekse heterogene vev. Hvordan skaffe celletypespesifikke RNA blir et presserende behov for å frigjøre den kraftige RNA-seq-teknikken. Isoleringen av celletypespesifikke RNA er vanligvis avhengig av innsamling av en bestemt type celler ved hjelp av mikromanipulering, fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) eller laserfangstmikrodisseksjon (LCM)18. Andre moderne single-cell innsamlingsmetoder og instrumenter med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH R00HD082686. Vi takker Endocrine Society Summer Research Fellowship til H.S.Z. Vi takker også Dr. Yuan Kang for avl og vedlikehold av musekolonien.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
