Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular
Summary
Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.
Abstract
La heterogeneidad celular plantea desafíos para comprender la función de los tejidos complejos a nivel del transcriptoma. El uso de ARN específicos del tipo de célula evita posibles dificultades causadas por la heterogeneidad de los tejidos y desencadena el poderoso análisis del transcriptoma. El protocolo descrito aquí demuestra cómo utilizar el método de purificación de afinidad ribosómica (TRAP) para aislar ARN unidos a ribosomas de una pequeña cantidad de células que expresan EGFP en un tejido complejo sin clasificación celular. Este protocolo es adecuado para aislar ARN específicos de tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP recientemente disponible y también podría usarse para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.
Introduction
Los enfoques de alto rendimiento, incluida la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el microarray, han permitido interrogar los perfiles de expresión génica a nivel de todo el genoma. Para tejidos complejos como el corazón, el cerebro y los testículos, los datos específicos del tipo de célula proporcionarán más detalles comparando el uso de ARN de todo el tejido 1,2,3. Para superar el impacto de la heterogeneidad celular, el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) se ha desarrollado desde principios de la década de 20104. TRAP es capaz de aislar ARN unidos a ribosomas de tipos celulares específicos sin disociación tisular. Este método se ha utilizado para el análisis de translatoma (ARNm que están siendo reclutados para el ribosoma para la traducción) en diferentes organismos, incluyendo la orientación a una población extremadamente rara de células musculares en embriones de Drosophila5, el estudio de diferentes células radiculares en la planta modelo Arabidopsis thaliana6, y la realización de análisis del transcriptoma de células endoteliales en mamíferos7.
TRAP requiere una modificación genética para marcar el ribosoma de un organismo modelo. Evan Rosen y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de ratón llamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, que ha estado disponible a través del Laboratorio Jackson desde 2017. Al cruzarse con una línea de ratón Cre, los investigadores pueden usar este modelo de ratón NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas y núcleos celulares de células que expresan Cre sin clasificación celular. En las células que expresan Cre que también portan el alelo NuTRAP , el ribosoma marcado con EGFP / L10a permite el aislamiento de la traducción de ARNm utilizando ensayos de afinidad pulldown. En la misma célula, la membrana nuclear marcada con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP), que también es mCherry positivo, permite el aislamiento nuclear mediante el uso de purificación basada en afinidad o fluorescencia. El mismo equipo de investigación también generó una línea de ratón similar en la que la membrana nuclear se etiqueta solo con mCherry sin biotina8. Estas dos líneas de ratones modificados genéticamente dan acceso a caracterizar perfiles epigenómicos y transcriptómicos pareados de tipos específicos de células de interés.
La vía de señalización del erizo (Hh) juega un papel crítico en el desarrollo del tejido9. GLI1, un miembro de la familia GLI, actúa como un activador transcripcional y media la señalización de Hh. Las células Gli1+ se pueden encontrar en muchos órganos secretores de hormonas, incluyendo la glándula suprarrenal y los testículos. Para aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de las células Gli1+ utilizando el modelo de ratón NuTRAP, se cruzaron ratones Gli1-CreERT2 con ratones NuTRAP. Los ratones Shh-CreERT2 también se cruzaron con los ratones NuTRAP con el objetivo de aislar las células que expresan erizo sónico (Shh). El siguiente protocolo muestra cómo utilizar Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas de células Gli1+ en testículos de ratones adultos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La utilidad del análisis del transcriptoma de tejido completo podría amortiguarse, especialmente cuando se estudian tejidos heterogéneos complejos. Cómo obtener ARN específicos de tipo celular se convierte en una necesidad urgente para desatar la poderosa técnica RNA-seq. El aislamiento de ARN específicos del tipo celular generalmente se basa en la recolección de un tipo específico de células mediante micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o microdisección por captura lás…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente apoyado por NIH R00HD082686. Agradecemos la beca de investigación de verano de la Endocrine Society a H.S.Z. También agradecemos al Dr. Yuan Kang por criar y mantener la colonia de ratones.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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