Isolera celltypspecifika RNA från snap-frozen heterogena vävnadsprover utan cellsortering
Summary
Detta protokoll syftar till att isolera celltypspecifika översättning ribosomala mRNA med hjälp av NuTRAP-musmodellen.
Abstract
Cellulär heterogenitet innebär utmaningar för att förstå funktionen hos komplexa vävnader på transkriptomnivå. Genom att använda celltypspecifika RNA undviks potentiella fallgropar orsakade av vävnadernas heterogenitet och släpper loss den kraftfulla transkriptomanalysen. Protokollet som beskrivs här visar hur man använder metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) för att isolera ribosombundna RNA från en liten mängd EGFP-uttryckande celler i en komplex vävnad utan cellsortering. Detta protokoll är lämpligt för att isolera celltypspecifika RNA med den nyligen tillgängliga NuTRAP-musmodellen och kan också användas för att isolera RNA från alla EGFP-uttryckande celler.
Introduction
Metoder med hög genomströmning, inklusive RNA-sekvensering (RNA-seq) och mikroarray, har gjort det möjligt att förhöra genuttrycksprofiler på genomomfattande nivå. För komplexa vävnader som hjärta, hjärna och testiklar kommer celltypspecifika data att ge mer information som jämför användningen av RNA från hela vävnaden 1,2,3. För att övervinna effekterna av cellulär heterogenitet har metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) utvecklats sedan början av 2010-talet4. TRAP kan isolera ribosombundna RNA från specifika celltyper utan vävnadsdissociation. Denna metod har använts för translatom (mRNA som rekryteras till ribosomen för översättning) analys i olika organismer, inklusive inriktning på en extremt sällsynt population av muskelceller i Drosophila embryon5, studera olika rotceller i modellväxten Arabidopsis thaliana6 och utföra transkriptomanalys av endotelceller hos däggdjur7.
TRAP kräver en genetisk modifiering för att märka ribosomen hos en modellorganism. Evan Rosen och kollegor utvecklade nyligen en musmodell som heter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har varit tillgänglig via Jackson Laboratory sedan 2017. Genom att korsa med en Cre-muslinje kan forskare använda denna NuTRAP-musmodell för att isolera ribosombundna RNA och cellkärnor från Cre-uttryckande celler utan cellsortering. I Cre-uttryckande celler som också bär NuTRAP-allelen tillåter EGFP / L10a-taggad ribosom isolering av översättning av mRNA med hjälp av affinitetspulldown-analyser. I samma cell tillåter det biotinligasigenkänningspeptid (BLRP) -märkta kärnmembranet, som också är mCherry-positivt, kärnisolering genom att använda affinitets- eller fluorescensbaserad rening. Samma forskargrupp genererade också en liknande muslinje där kärnmembranet endast är märkt med mCherry utan biotin8. Dessa två genetiskt modifierade muslinjer ger tillgång till att karakterisera parade epigenomiska och transkriptomiska profiler av specifika typer av celler i intresse.
Signalvägen för igelkott (Hh) spelar en avgörande roll i vävnadsutveckling9. GLI1, en medlem av GLI-familjen, fungerar som en transkriptionell aktivator och förmedlar Hh-signaleringen. Gli1+ celler finns i många hormonutsöndrande organ, inklusive binjurarna och testiklarna. För att isolera celltypsspecifika DNA och RNA från Gli1+-celler med hjälp av NuTRAP-musmodellen korsades Gli1-CreERT2-möss med NuTRAP-mössen. Shh-CreERT2-möss korsades också med NuTRAP-mössen som syftar till att isolera sonisk igelkott (Shh) som uttrycker celler. Följande protokoll visar hur du använder Gli1-CreERT2; NuTRAP-möss för att isolera ribosombundna RNA från Gli1+-celler i vuxna mustestiklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användbarheten av transkriptomanalysen i hela vävnaden kan dämpas, särskilt när man studerar komplexa heterogena vävnader. Hur man erhåller celltypsspecifika RNA blir ett brådskande behov av att frigöra den kraftfulla RNA-seq-tekniken. Isoleringen av celltypspecifika RNA är vanligtvis beroende av insamling av en specifik typ av celler med hjälp av mikromanipulation, fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) eller laserfångningsmikrodissektion (LCM)18. Andra moderna encellsinsamling…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av NIH R00HD082686. Vi tackar Endocrine Society Summer Research Fellowship till H.S.Z. Vi tackar också Dr. Yuan Kang för avel och underhåll av muskolonin.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
