Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin
Summary
Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA’ları izole etmeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Hücresel heterojenlik, transkriptom düzeyinde karmaşık dokuların işlevini anlamada zorluklar yaratır. Hücre tipine özgü RNA’ların kullanılması, dokuların heterojenliğinin neden olduğu potansiyel tuzakları önler ve güçlü transkriptom analizini serbest bırakır. Burada açıklanan protokol, ribozoma bağlı RNA’ları, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az miktarda EGFP eksprese eden hücrelerden izole etmek için Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yönteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu protokol, yakın zamanda mevcut olan NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü RNA’ları izole etmek için uygundur ve RNA’ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de kullanılabilir.
Introduction
RNA dizilimi (RNA-seq) ve mikroarray dahil olmak üzere yüksek verimli yaklaşımlar, gen ekspresyon profillerinin genom çapında sorgulanmasını mümkün kılmıştır. Kalp, beyin ve testis gibi karmaşık dokular için, hücre tipine özgü veriler, RNA’ların tüm dokudaki kullanımını karşılaştıran daha fazla ayrıntı sağlayacaktır 1,2,3. Hücresel heterojenliğin etkisinin üstesinden gelmek için, Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yöntemi 2010’ların başından berigeliştirilmiştir4. TRAP, ribozoma bağlı RNA’ları doku ayrışması olmadan spesifik hücre tiplerinden izole edebilir. Bu yöntem, Drosophila embriyoları5’te son derece nadir görülen bir kas hücresi popülasyonunu hedeflemek, Arabidopsis thaliana6 model bitkisindeki farklı kök hücreleri incelemek ve memelilerde endotel hücrelerinin transkriptom analizini yapmak da dahil olmak üzere farklı organizmalarda translatom (çeviri için ribozoma alınan mRNA’lar) analizi için kullanılmıştır7.
TRAP, bir model organizmanın ribozomunu etiketlemek için genetik bir modifikasyon gerektirir. Evan Rosen ve meslektaşları yakın zamanda Jackson Laboratuvarı’nda 2017’den beri mevcut olan Nükleer etiketleme ve Çeviri Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) fare8 adlı bir fare modeli geliştirdiler. Bir Cre fare çizgisiyle geçerek, araştırmacılar bu NuTRAP fare modelini, ribozom bağlı RNA’ları ve hücre çekirdeklerini, hücre sıralama olmadan Cre-eksprese eden hücrelerden izole etmek için kullanabilirler. NuTRAP alelini de taşıyan Cre-eksprese eden hücrelerde, EGFP / L10a etiketli ribozom, afinite pulldown tahlilleri kullanarak mRNA’ların çevrilmesinin izolasyonuna izin verir. Aynı hücrede, aynı zamanda mCherry pozitif olan biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli nükleer membran, afinite veya floresan bazlı saflaştırma kullanarak nükleer izolasyona izin verir. Aynı araştırma ekibi, nükleer membranın sadece biyotin8 içermeyen mCherry ile etiketlendiği benzer bir fare hattı da üretti. Genetiği değiştirilmiş bu iki fare çizgisi, ilgilenilen belirli hücre tiplerinin eşleştirilmiş epigenomik ve transkriptomik profillerini karakterize etmek için erişim sağlar.
Kirpi (Hh) sinyal yolu doku gelişiminde kritik bir rol oynar9. GLI ailesinin bir üyesi olan GLI1, transkripsiyonel bir aktivatör görevi görür ve Hh sinyaline aracılık eder. Gli1 + hücreleri, adrenal bez ve testis de dahil olmak üzere birçok hormon salgılayan organda bulunabilir. NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü DNA’ları ve RNA’ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için, Gli1-CreERT2 fareleri NuTRAP fareleri ile çaprazlandı. Shh-CreERT2 fareleri, sonik kirpi (Shh) eksprese eden hücreleri izole etmeyi amaçlayan NuTRAP fareleri ile de geçti. Aşağıdaki protokol Gli1-CreERT2’nin nasıl kullanılacağını gösterir; NuTRAP fareleri, yetişkin fare testislerinde ribozoma bağlı RNA’ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm doku transkriptom analizinin yararlılığı, özellikle karmaşık heterojen dokuları incelerken azaltılabilir. Hücre tipine özgü RNA’ların nasıl elde edileceği, güçlü RNA-seq tekniğini ortaya çıkarmak için acil bir ihtiyaç haline gelir. Hücre tipine özgü RNA’ların izolasyonu genellikle mikromanipülasyon, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) kullanılarak belirli bir hücre tipinin toplanmasına dayanır18. Diğe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen NIH R00HD082686 tarafından desteklenmiştir. Endokrin Derneği Yaz Araştırma Bursu’na H.S.Z.’ye teşekkür ederiz. Ayrıca fare kolonisini yetiştirdiği ve koruduğu için Dr. Yuan Kang’a teşekkür ederiz.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
