Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol
Summary
Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.
Abstract
Het gebruik van onconventionele modellen om aangeboren immuniteit en pathogene virulentie te bestuderen, biedt een waardevol alternatief voor zoogdiermodellen, die kostbaar kunnen zijn en ethische problemen kunnen oproepen. Onconventionele modellen zijn notoir goedkoop, gemakkelijk te hanteren en cultuur, en nemen niet veel ruimte in beslag. Ze zijn genetisch vatbaar en bezitten volledige genoomsequenties, en het gebruik ervan brengt geen ethische overwegingen met zich mee. De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft bijvoorbeeld geweldige inzichten gegeven in een verscheidenheid aan gedrag, ontwikkeling, metabolisme en immuniteitsonderzoek. Meer specifiek bezitten D. melanogaster volwassen vliegen en larven verschillende aangeboren afweerreacties die worden gedeeld met gewervelde dieren. De mechanismen die immuunresponsen reguleren, zijn meestal onthuld door genetische en moleculaire studies in het D. melanogaster-model . Hier wordt een nieuwe larvale injectietechniek aangeboden, die het onderzoek naar aangeboren immuunprocessen in D. melanogaster-larven verder zal bevorderen en de pathogenese van een breed scala aan microbiële infecties zal onderzoeken.
Introduction
Drosophila melanogaster wordt al tientallen jaren enorm gebruikt in biologisch en biomedisch onderzoek, omdat de geavanceerde reeks genetische en moleculaire hulpmiddelen gestaag is geëvolueerd voor analyse van een breed scala aan studies1,2,3,4. De evolutionair geconserveerde aspecten van ontwikkeling, homeostase en aangeboren immuniteit in D. melanogaster hebben het tot een waardevol modelorganisme gemaakt voor het bestuderen van verschillende menselijke en insectenziekten5,6. Met name de fundamentele rol van het D. melanogaster-model voor het bestuderen van immuniteit is grotendeels geïllustreerd in studies naar volwassen vliegen. D. melanogaster larvenstudies hebben echter ook bijgedragen aan de huidige kennis en hebben voornamelijk cellulaire immuunresponsen onderzocht, specifiek voor wespen- en nematodeninfecties die optreden via de insectensnoekel7,8,9,10. Drosophila melanogaster-larven bezitten drie verschillende soorten bloedcellen, gezamenlijk hemocyten genoemd: plasmatocyten, kristalcellen en lamellocyten11,12,13. Deze cellen kunnen een reeks immuunresponsen opzetten wanneer D. melanogaster-larven zijn geïnfecteerd met pathogenen zoals bacteriën, schimmels, virussen en parasieten14,15,16. Cellulaire immuunresponsen omvatten directe overspoeling (fagocytose) van kleine moleculen of bacteriën, melanisatie, inkapseling van grotere pathogenen zoals parasitoïde eieren en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en stikstofmonoxidesynthasen (NOS)17,18,19.
Daarentegen zijn er minder studies gepubliceerd over het gebruik van het D. melanogaster larvale model om humorale immuunresponsen te analyseren. Dit is voornamelijk te wijten aan de toepassing van voedingstests voor orale infectie van D. melanogaster-larven en verschillende uitdagingen in verband met micro-injectielarven, waaronder de precieze behandeling van larven en het juiste gebruik van de micronaald, vooral tijdens penetratie20,21. De beperkte kennis van larvale infectie en technische problemen (d.w.z. hoge mortaliteit) hebben het D. melanogaster larvale model vaak moeilijk te gebruiken gemaakt. Een larvaal model zal het potentieel hebben om nieuwe moleculaire mechanismen te identificeren die meer inzicht zullen geven in gastheer-pathogeen interacties en de inductie van specifieke gastheer aangeboren immuunresponsen tegen pathogene infecties.
Hier wordt een eenvoudig en efficiënt protocol beschreven dat kan worden gebruikt om D. melanogaster-larven te injecteren met verschillende pathogenen, zoals bacteriën. In het bijzonder worden D. melanogaster-larven gebruikt voor injecties met de menselijke ziekteverwekker Photorhabdus asymbiotica en de niet-pathogene bacterie Escherichia coli. Deze methode kan worden gebruikt voor de manipulatie en analyse van de immuunresponsen van D. melanogaster op verschillende microbiële infecties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster is een van de meest waardevolle, experimenteel gemanipuleerde modellen die worden gebruikt voor onderzoek naar aangeboren immuniteit en pathogenese van verschillende microbiële infecties. Dit komt door de eenvoudige en snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud in een laboratorium, gevestigde evolutionaire genetica en diverse genetische toolbox. Eerdere methoden van D. melanogaster-larveninjecties, zoals het gebruik van een hybride microfluïdisch apparaat of een Narishige microma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken leden van de afdeling Biologische Wetenschappen van de George Washington University (GWU) voor het kritisch lezen van het manuscript. GT werd ondersteund door een Harlan summer fellowship van GWU. Alle grafische figuren zijn gemaakt met Behulp van BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. 유전학. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
