Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll
Summary
Drosophila melanogaster erwachsene Fliegen wurden ausgiebig als Modellorganismen verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die antimikrobiellen angeborenen Immunantworten des Wirts und mikrobiellen Infektionsstrategien zugrunde liegen. Um das Larvenstadium von D. melanogaster als zusätzliches oder alternatives Modellsystem zu fördern, wird eine Larveninjektionstechnik beschrieben.
Abstract
Die Verwendung unkonventioneller Modelle zur Untersuchung der angeborenen Immunität und der Virulenz von Krankheitserregern bietet eine wertvolle Alternative zu Säugetiermodellen, die kostspielig sein und ethische Fragen aufwerfen können. Unkonventionelle Modelle sind notorisch billig, einfach zu handhaben und zu kultivieren und nehmen nicht viel Platz in Anspruch. Sie sind genetisch zugänglich und besitzen vollständige Genomsequenzen, und ihre Verwendung wirft keine ethischen Überlegungen auf. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster zum Beispiel hat großartige Einblicke in eine Vielzahl von Verhaltens-, Entwicklungs-, Stoffwechsel- und Immunitätsforschungen gegeben. Genauer gesagt, D. melanogaster erwachsene Fliegen und Larven besitzen mehrere angeborene Abwehrreaktionen, die mit Wirbeltieren geteilt werden. Die Mechanismen, die Immunantworten regulieren, wurden hauptsächlich durch genetische und molekulare Studien im D. melanogaster-Modell aufgedeckt. Hier wird eine neuartige Larveninjektionstechnik bereitgestellt, die die Untersuchung angeborener Immunprozesse in D. melanogaster-Larven weiter vorantreiben und die Pathogenese einer Vielzahl von mikrobiellen Infektionen erforschen wird.
Introduction
Drosophila melanogaster wird seit mehreren Jahrzehnten in der biologischen und biomedizinischen Forschung immens eingesetzt, da sich die ausgeklügelte Palette genetischer und molekularer Werkzeuge für die Analyse einer Vielzahl von Studien1,2,3,4 stetig weiterentwickelt hat. Die evolutionär konservierten Aspekte der Entwicklung, der Homöostase und der angeborenen Immunität bei D. melanogaster haben es zu einem wertvollen Modellorganismus für die Untersuchung verschiedener menschlicher und Insektenkrankheiten gemacht5,6. Insbesondere die grundlegende Rolle des D. melanogaster-Modells für die Untersuchung der Immunität wurde weitgehend in Studien mit erwachsenen Fliegen veranschaulicht. D. melanogaster Larvenstudien haben jedoch auch zum aktuellen Wissen beigetragen und hauptsächlich zelluläre Immunantworten untersucht, insbesondere für Wespen- und Nematodeninfektionen, die durch die Insektenkutikula auftreten7,8,9,10. Drosophila melanogaster Larven besitzen drei verschiedene Arten von Blutzellen, die zusammen Hämozyten genannt werden: Plasmatozyten, Kristallzellen und Lamellozyten11,12,13. Diese Zellen können eine Reihe von Immunantworten aufbauen, wenn D. melanogaster-Larven mit Krankheitserregern wie Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten infiziert sind14,15,16. Zu den zellulären Immunantworten gehören die direkte Verschlingung (Phagozytose) von kleinen Molekülen oder Bakterien, die Melanisierung, die Verkapselung größerer Krankheitserreger wie parasitoide Eier und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Stickstoffmonoxidsynthasen (NOS)17,18,19.
Im Gegensatz dazu wurden weniger Studien über die Verwendung des D. melanogaster-Larvenmodells zur Analyse humoraler Immunantworten veröffentlicht. Dies ist hauptsächlich auf die Anwendung von Fütterungsassays für die orale Infektion von D. melanogaster-Larven und mehrere Herausforderungen im Zusammenhang mit der Mikroinjektion von Larven zurückzuführen, einschließlich der präzisen Handhabung von Larven und der ordnungsgemäßen Verwendung der Mikronadel, insbesondere während der Penetration20,21. Daher haben das begrenzte Wissen über Larveninfektionen und technische Schwierigkeiten (d.h. hohe Mortalität) das Larvenmodell von D. melanogaster häufig schwierig gemacht. Ein Larvenmodell wird das Potenzial haben, neue molekulare Mechanismen zu identifizieren, die weitere Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen und die Induktion spezifischer angeborener Immunantworten des Wirts gegen pathogene Infektionen liefern werden.
Hier wird ein einfaches und effizientes Protokoll beschrieben, mit dem D. melanogaster-Larven verschiedene Krankheitserreger, wie z.B. Bakterien, injiziert werden können. Insbesondere D. melanogaster Larven werden für Injektionen mit dem humanpathogenen Photorhabdus asymbiotica und dem nicht-pathogenen Bakterium Escherichia coli verwendet. Diese Methode kann zur Manipulation und Analyse der Immunantwort von D. melanogaster auf verschiedene mikrobielle Infektionen eingesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster gehört zu den wertvollsten, experimentell manipulierten Modellen, die zur Untersuchung der angeborenen Immunität und Pathogenese verschiedener mikrobieller Infektionen verwendet werden. Dies liegt an seinem einfachen und schnellen Lebenszyklus, der einfachen Wartung in einem Labor, der gut etablierten evolutionären Genetik und der vielfältigen genetischen Toolbox. Frühere Methoden der D. melanogaster-Larveninjektion, wie die Verwendung eines hybriden mikrofluidischen Geräts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitgliedern des Department of Biological Sciences der George Washington University (GWU) für die kritische Lektüre des Manuskripts. GT wurde durch ein Harlan-Sommerstipendium der GWU unterstützt. Alle grafischen Figuren wurden mit BioRender erstellt.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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