ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा इंजेक्शन प्रोटोकॉल
Summary
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर वयस्क मक्खियों को बड़े पैमाने पर मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया गया है ताकि मेजबान रोगाणुरोधी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और माइक्रोबियल संक्रमण रणनीतियों के अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच की जा सके। एक अतिरिक्त या वैकल्पिक मॉडल प्रणाली के रूप में डी मेलानोगास्टर लार्वा चरण को बढ़ावा देने के लिए, एक लार्वा इंजेक्शन तकनीक का वर्णन किया गया है।
Abstract
जन्मजात प्रतिरक्षा और रोगज़नक़ विषाणु का अध्ययन करने के लिए अपरंपरागत मॉडल का उपयोग स्तनधारी मॉडल के लिए एक मूल्यवान विकल्प प्रदान करता है, जो महंगा हो सकता है और नैतिक मुद्दों को उठा सकता है। अपरंपरागत मॉडल कुख्यात रूप से सस्ते, संभालने और संस्कृति में आसान हैं, और बहुत अधिक जगह नहीं लेते हैं। वे आनुवंशिक रूप से अनुकूल हैं और पूर्ण जीनोम अनुक्रमों के अधिकारी हैं, और उनका उपयोग कोई नैतिक विचार प्रस्तुत नहीं करता है। फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, उदाहरण के लिए, व्यवहार, विकास, चयापचय और प्रतिरक्षा अनुसंधान की एक किस्म में महान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। अधिक विशेष रूप से, डी मेलानोगास्टर वयस्क मक्खियों और लार्वा में कई जन्मजात रक्षा प्रतिक्रियाएं होती हैं जो कशेरुकी जानवरों के साथ साझा की जाती हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने वाले तंत्र ज्यादातर डी मेलानोगास्टर मॉडल में आनुवंशिक और आणविक अध्ययन के माध्यम से प्रकट हुए हैं। यहां एक उपन्यास लार्वा इंजेक्शन तकनीक प्रदान की जाती है, जो डी मेलानोगास्टर लार्वा में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं की जांच को बढ़ावा देगी और माइक्रोबियल संक्रमणों की एक विस्तृत श्रृंखला के रोगजनन का पता लगाएगी।
Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का कई दशकों से जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में अत्यधिक उपयोग किया गया है, क्योंकि आनुवंशिक और आणविक उपकरणों की परिष्कृत सरणी लगातार अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के विश्लेषण के लिए विकसित हुई है1,2,3,4। विकास, होमियोस्टैसिस और डी मेलानोगास्टर में जन्मजात प्रतिरक्षा के विकासवादी रूप से संरक्षित पहलुओं ने इसे विभिन्न मानव और कीट रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव बना दिया है5,6। विशेष रूप से, प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए डी मेलानोगास्टर मॉडल की मौलिक भूमिका को वयस्क मक्खियों के अध्ययन में काफी हद तक उदाहरण दिया गया है। हालांकि, डी मेलानोगास्टर लार्वा अध्ययनों ने वर्तमान ज्ञान में भी योगदान दिया है और मुख्य रूप से सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पता लगाया है, विशेष रूप से ततैया और नेमाटोड संक्रमण के लिए जो कीट छल्ली 7,8,9,10 के माध्यम से होते हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा में तीन अलग-अलग प्रकार की रक्त कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें सामूहिक रूप से हेमोसाइट्स कहा जाता है: प्लाज्माटोसाइट्स, क्रिस्टल कोशिकाएं और लैमेलोसाइट्स 11,12,13। ये कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक सरणी को माउंट कर सकती हैं जब डी मेलानोगास्टर लार्वा बैक्टीरिया, कवक, वायरस और परजीवी जैसे रोगजनकों से संक्रमित होते हैं14,15,16। सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में छोटे अणुओं या बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष निगलने (फागोसाइटोसिस), मेलेनाइजेशन, परजीवी अंडे जैसे बड़े रोगजनकों के encapsulation, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (एनओएस) का उत्पादन 17,18,19 शामिल हैं।
इसके विपरीत, ह्यूमरस प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए डी मेलानोगास्टर लार्वा मॉडल के उपयोग पर कम अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं। यह मुख्य रूप से डी मेलानोगास्टर लार्वा के मौखिक संक्रमण के लिए फीडिंग एसेस के आवेदन के कारण है और लार्वा के सटीक हैंडलिंग और माइक्रोनीडल के उचित उपयोग सहित माइक्रोइंजेक्शन लार्वा से जुड़ी कई चुनौतियों के कारण है, विशेष रूप से प्रवेश के दौरान 20,21। इस प्रकार, लार्वा संक्रमण और तकनीकी कठिनाइयों (यानी, उच्च मृत्यु दर) के सीमित ज्ञान ने अक्सर डी मेलानोगास्टर लार्वा मॉडल का उपयोग करना मुश्किल बना दिया है। एक लार्वा मॉडल में उपन्यास आणविक तंत्र की पहचान करने की क्षमता होगी जो मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और रोगजनक संक्रमणों के खिलाफ विशिष्ट मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को शामिल करेगा।
यहां एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल जिसका उपयोग विभिन्न रोगजनकों, जैसे बैक्टीरिया के साथ डी मेलानोगास्टर लार्वा को इंजेक्ट करने के लिए किया जा सकता है, का विस्तार से वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, डी मेलानोगास्टर लार्वा का उपयोग मानव रोगज़नक़ फोटोरहाब्डस सहजीवी और गैर-रोगजनक बैक्टीरिया एस्चेरिचिया कोलाई के साथ इंजेक्शन के लिए किया जाता है। इस विधि का उपयोग विभिन्न माइक्रोबियल संक्रमणों के लिए डी मेलानोगास्टर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के हेरफेर और विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर सबसे मूल्यवान, प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किए गए मॉडलों में से एक है जो विभिन्न माइक्रोबियल संक्रमणों के जन्मजात प्रतिरक्षा और रोगजनन की जांच के लिए उपयोग किया जाता है। यह …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय (GWU) में जैविक विज्ञान विभाग के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। जीटी को जीडब्ल्यूयू से हारलान ग्रीष्मकालीन फैलोशिप के माध्यम से समर्थित किया गया था। सभी ग्राफिकल आंकड़े BioRender का उपयोग करके बनाए गए थे।
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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