Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva
Summary
Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell’ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.
Abstract
L’uso di modelli non convenzionali per studiare l’immunità innata e la virulenza dei patogeni fornisce una valida alternativa ai modelli di mammiferi, che possono essere costosi e sollevare questioni etiche. I modelli non convenzionali sono notoriamente economici, facili da maneggiare e cultura e non occupano molto spazio. Sono geneticamente suscettibili e possiedono sequenze genomiche complete e il loro uso non presenta considerazioni etiche. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, ad esempio, ha fornito grandi intuizioni su una varietà di comportamento, sviluppo, metabolismo e ricerca sull’immunità. Più specificamente, le mosche e le larve adulte di D. melanogaster possiedono diverse reazioni di difesa innate che sono condivise con gli animali vertebrati. I meccanismi che regolano le risposte immunitarie sono stati per lo più rivelati attraverso studi genetici e molecolari nel modello D. melanogaster . Qui viene fornita una nuova tecnica di iniezione larvale, che promuoverà ulteriormente le indagini sui processi immunitari innati nelle larve di D. melanogaster ed esplorerà la patogenesi di una vasta gamma di infezioni microbiche.
Introduction
Drosophila melanogaster è stata immensamente utilizzata nella ricerca biologica e biomedica per diversi decenni, poiché la sofisticata gamma di strumenti genetici e molecolari si è costantemente evoluta per l’analisi di una vasta gamma di studi1,2,3,4. Gli aspetti evolutivamente conservati dello sviluppo, dell’omeostasi e dell’immunità innata in D. melanogaster lo hanno reso un prezioso organismo modello per lo studio di varie malattie umane e degli insetti5,6. In particolare, il ruolo fondamentale del modello di D. melanogaster per lo studio dell’immunità è stato ampiamente esemplificato negli studi sulle mosche adulte. Tuttavia, gli studi sulle larve di D. melanogaster hanno anche contribuito alle conoscenze attuali e hanno esplorato principalmente le risposte immunitarie cellulari, in particolare per le infezioni da vespe e nematodi che si verificano attraverso la cuticola degli insetti7,8,9,10. Le larve di Drosophila melanogaster possiedono tre diversi tipi di cellule del sangue, collettivamente chiamate emociti: plasmatociti, cellule cristalline e lamellociti11,12,13. Queste cellule possono montare una serie di risposte immunitarie quando le larve di D. melanogaster sono infettate da agenti patogeni come batteri, funghi, virus e parassiti14,15,16. Le risposte immunitarie cellulari includono l’inghiottimento diretto (fagocitosi) di piccole molecole o batteri, la melanizzazione, l’incapsulamento di agenti patogeni più grandi come le uova parassitoidi e la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e ossido nitrico sintasi (NOS)17,18,19.
Al contrario, sono stati pubblicati meno studi sull’uso del modello larvale D. melanogaster per analizzare le risposte immunitarie umorali. Ciò è dovuto principalmente all’applicazione di saggi di alimentazione per l’infezione orale delle larve di D. melanogaster e a diverse sfide associate alla microiniezione di larve, tra cui la manipolazione precisa delle larve e l’uso corretto del microaghi, specialmente durante la penetrazione20,21. Pertanto, la limitata conoscenza dell’infezione larvale e le difficoltà tecniche (cioè l’alta mortalità) hanno spesso reso difficile l’uso del modello larvale di D. melanogaster. Un modello larvale avrà il potenziale per identificare nuovi meccanismi molecolari che forniranno ulteriori approfondimenti sulle interazioni ospite-patogeno e sull’induzione di specifiche risposte immunitarie innate dell’ospite contro le infezioni patogene.
Qui viene descritto in dettaglio un protocollo semplice ed efficiente che può essere utilizzato per iniettare larve di D. melanogaster con vari agenti patogeni, come i batteri. In particolare, le larve di D. melanogaster sono utilizzate per iniezioni con il patogeno umano Photorhabdus asymbiotica e il batterio non patogeno Escherichia coli. Questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione e l’analisi delle risposte immunitarie di D. melanogaster a varie infezioni microbiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster è tra i modelli più preziosi e manipolati sperimentalmente utilizzati per le indagini sull’immunità innata e sulla patogenesi di varie infezioni microbiche. Ciò è dovuto al suo ciclo di vita semplice e veloce, alla semplice manutenzione in laboratorio, alla genetica evolutiva ben consolidata e alla diversa cassetta degli attrezzi genetica. I precedenti metodi di iniezioni di larve di D. melanogaster, come l’utilizzo di un dispositivo microfluidico ibrido o di un micromanipol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University (GWU) per la lettura critica del manoscritto. GT è stato supportato attraverso una borsa di studio estiva Harlan da GWU. Tutte le figure grafiche sono state realizzate utilizzando BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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