キイロショウジョウバエ 幼虫注入プロトコル
Summary
ショウジョウバエのメラノガスター 成虫ハエは、宿主の抗菌自然免疫応答および微生物感染戦略の根底にある分子メカニズムを調べるためのモデル生物として広く利用されてきた。追加的または代替的なモデル系として D.メラノガスター 幼虫期を促進するための、幼虫注入技術が記載されている。
Abstract
自然免疫と病原体の毒性を研究するための型破りなモデルの使用は、哺乳類モデルに代わる貴重な代替手段を提供し、費用がかかり、倫理的問題を提起する可能性があります。型破りなモデルは、安価で扱いやすく、文化が容易で、スペースを取らないことで有名です。彼らは遺伝的に従順であり、完全なゲノム配列を有し、それらの使用は倫理的考慮を提示しない。例えば、ショウ ジョウバエのメラノガスターは、さまざまな行動、発達、代謝、免疫研究に大きな洞察を与えてきました。より具体的には、 D. melanogaster 成虫のハエおよび幼虫は、脊椎動物と共有されるいくつかの先天的な防御反応を有する。免疫応答を調節するメカニズムは、 D. melanogaster モデルにおける遺伝的および分子的研究によって主に明らかにされている。ここでは、 D. melanogaster 幼虫における自然免疫プロセスの調査をさらに促進し、広範囲の微生物感染の病因を探る新規幼虫注入技術が提供される。
Introduction
ショウジョウバエのメラノガスターは、幅広い研究の分析のために洗練された遺伝的および分子的ツールの配列が着実に進化してきたため、数十年にわたって生物学的および生物医学的研究に大いに利用されてきました1,2,3,4。D. melanogasterの発達、恒常性、自然免疫の進化的に保存された側面は、さまざまなヒトおよび昆虫の病気を研究するための貴重なモデル生物となっています5,6。特に、免疫を研究するためのD.メラノガスターモデルの基本的な役割は、成虫のハエ研究において大きく例示されている。しかし、D. melanogaster幼虫の研究も現在の知識に貢献し、主に昆虫のキューティクルを介して起こるワタおよび線虫感染に対する細胞性免疫応答を探求した7,8,9,10。ショウジョウバエのメラノガスター幼虫は、血球細胞、結晶細胞、および層状細胞の3つの異なるタイプの血液細胞、総称して血球を有する11,12,13。これらの細胞は、D.メラノガスターの幼虫が細菌、真菌、ウイルス、寄生虫などの病原体に感染している場合に、一連の免疫応答をマウントすることができます14,15,16。細胞性免疫応答には、小分子または細菌の直接巻き込み(貪食作用)、メラニン化、寄生卵などのより大きな病原体のカプセル化、活性酸素種(ROS)および一酸化窒素合成酵素(NOS)の産生が含まれる17,18,19。
対照的に、体液性免疫応答を分析するためのD. melanogaster幼虫モデルの使用に関する研究は少ない。これは主に、D. melanogaster幼虫の経口感染に対する摂食アッセイの適用と、特に浸透中の幼虫の正確な取り扱いおよびマイクロニードルの適切な使用を含む、幼虫の微量注入に関連するいくつかの課題によるものである20,21。したがって、幼虫感染に関する限られた知識および技術的困難(すなわち、高い死亡率)は、しばしばD.メラノガスター幼虫モデルの使用を困難にしている。幼虫モデルは、宿主-病原体相互作用および病原性感染に対する特定の宿主自然免疫応答の誘導に関するさらなる洞察を提供する新規分子機構を同定する可能性を秘めている。
ここでは、 D.メラノガスター 幼虫に細菌などの様々な病原体を注入するために使用できるシンプルで効率的なプロトコルが詳細に説明されています。特に、 D.メラノガスター 幼虫は、ヒト病原体 Photorhabdus asymbiotica および非病原性細菌 Escherichia coliとの注射に使用される。この方法は、様々な微生物感染に対する D.メラノガスター の免疫応答の操作および分析に使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ショウジョウバエのメラノガスターは、自然免疫と様々な微生物感染症の病因の調査に使用される最も価値のある、実験的に操作されたモデルの一つです。これは、そのシンプルで速いライフサイクル、実験室での簡単な維持、十分に確立された進化遺伝学、および多様な遺伝的ツールボックスによるものです。ハイブリッドマイクロ流体装置またはナリシゲマイクロマニピュレータ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジョージワシントン大学(GWU)の生物科学科のメンバーに、原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。GTはGWUのハーラン・サマー・フェローシップを通じて支援を受けました。すべてのグラフィカルな図はBioRenderを使用して作成されました。
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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