초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜
Summary
초파리 멜라노가스터 성인 파리는 숙주 항미생물 선천적 면역 반응 및 미생물 감염 전략의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 모델 유기체로서 광범위하게 활용되고 있다. D. melanogaster 유충 단계를 추가 또는 대안 모델 시스템으로서 촉진하기 위해, 애벌레 주입 기술이 기술된다.
Abstract
선천적 면역과 병원균 독성을 연구하기 위해 비전통적인 모델을 사용하는 것은 포유류 모델에 대한 귀중한 대안을 제공하며, 이는 비용이 많이 들고 윤리적 인 문제를 제기 할 수 있습니다. 틀에 얽매이지 않는 모델은 악명 높게도 저렴하고 취급하기 쉽고 문화가 쉬우며 많은 공간을 차지하지 않습니다. 그들은 유전적으로 순응성이 있고 완전한 게놈 서열을 가지고 있으며, 그들의 사용은 윤리적 인 고려 사항을 제시하지 않습니다. 예를 들어, 초파리 초파리 멜라노가스터는 다양한 행동, 발달, 신진 대사 및 면역 연구에 대한 훌륭한 통찰력을 제공했습니다. 보다 구체적으로, D. melanogaster 성인 파리와 애벌레는 척추 동물과 공유되는 몇 가지 선천적 인 방어 반응을 가지고 있습니다. 면역 반응을 조절하는 메커니즘은 대부분 D. melanogaster 모델의 유전 및 분자 연구를 통해 밝혀졌습니다. 여기에 새로운 애벌레 주입 기술이 제공되어 D. melanogaster 유충의 선천적 면역 과정에 대한 조사를 더욱 촉진하고 광범위한 미생물 감염의 발병 기전을 탐구합니다.
Introduction
초파리 멜라노가스터는 광범위한 연구의 분석을 위해 정교한 유전 및 분자 도구 배열이 꾸준히 진화함에 따라 수십 년 동안 생물학적 및 생물 의학 연구에 엄청나게 활용되어 왔습니다1,2,3,4. D. melanogaster의 발달, 항상성 및 선천적 면역의 진화적으로 보존 된 측면은 다양한 인간 및 곤충 질병을 연구하는 데 귀중한 모델 유기체가되었습니다5,6. 특히, 면역을 연구하기위한 D. melanogaster 모델의 근본적인 역할은 성인 파리 연구에서 크게 예시되었습니다. 그러나 D. melanogaster 유충 연구는 또한 현재의 지식에 기여했으며 주로 곤충 큐티클을 통해 발생하는 말벌 및 선충류 감염에 대한 세포 면역 반응을 탐구했습니다7,8,9,10. 초파리 멜라노가스터 유충은 혈구라고 불리는 세 가지 유형의 혈액 세포를 가지고 있습니다 : 혈장 세포, 결정 세포 및 lamellocytes11,12,13. 이 세포들은 D. melanogaster 애벌레가 박테리아, 곰팡이, 바이러스 및 기생충과 같은 병원균에 감염 될 때 일련의 면역 반응을 일으킬 수 있습니다14,15,16. 세포 면역 반응에는 소분자 또는 박테리아의 직접적인 삼킴 (식균증), 멜라닌화, 기생충 알과 같은 더 큰 병원체의 캡슐화, 반응성 산소 종 (ROS) 및 산화 질소 합성 효소 (NOS) 17,18,19의 생산이 포함됩니다.
대조적으로, 체액성 면역 반응을 분석하기 위해 D. melanogaster 애벌레 모델의 사용에 관한 연구는 거의 발표되지 않았습니다. 이것은 주로 D. melanogaster 유충의 구강 감염에 대한 먹이 분석의 적용과 유충의 정확한 취급 및 미세 바늘의 적절한 사용, 특히 침투 중 20,21을 포함하여 미세 주입 유충과 관련된 몇 가지 과제 때문입니다. 따라서, 유충 감염에 대한 제한된 지식과 기술적 어려움 (즉, 높은 사망률)은 종종 D. melanogaster 유충 모델을 사용하기 어렵게 만들었습니다. 애벌레 모델은 숙주-병원체 상호작용 및 병원성 감염에 대한 특정 숙주 선천적 면역 반응의 유도에 대한 추가적인 통찰을 제공할 새로운 분자 메카니즘을 식별할 수 있는 잠재력을 가질 것이다.
여기에 D. melanogaster 유충을 박테리아와 같은 다양한 병원균과 함께 주입하는 데 사용할 수있는 간단하고 효율적인 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다. 특히, D. melanogaster 유충은 인간 병원균 Photorhabdus asymbiotica 및 비병원성 박테리아 대장균과의 주사에 사용됩니다. 이 방법은 다양한 미생물 감염에 대한 D. melanogaster 의 면역 반응의 조작 및 분석에 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초파리 멜라노가스터는 다양한 미생물 감염의 선천적 면역 및 발병기전을 조사하는 데 사용되는 가장 가치 있고 실험적으로 조작된 모델 중 하나입니다. 이것은 간단하고 빠른 수명주기, 실험실에서의 간단한 유지, 잘 정립 된 진화 유전학 및 다양한 유전 도구 상자 때문입니다. D. melanogaster 유충 주사의 이전 방법, 예를 들어 하이브리드 미세 유체 장치 또는 Narishige 미세 조작기를 사…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 비판적 읽기에 대한 조지 워싱턴 대학 (GWU)의 생물 과학과의 구성원에게 감사드립니다. GT는 GWU의 Harlan 여름 펠로우십을 통해 지원되었습니다. 모든 그래픽 수치는 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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