Drosophila melanogaster Protocole d’injection de larves
Summary
Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.
Abstract
L’utilisation de modèles non conventionnels pour étudier l’immunité innée et la virulence des agents pathogènes constitue une alternative précieuse aux modèles de mammifères, ce qui peut être coûteux et soulever des questions éthiques. Les modèles non conventionnels sont notoirement bon marché, faciles à manipuler et à cultiver, et ne prennent pas beaucoup de place. Ils sont génétiquement disponibles et possèdent des séquences complètes du génome, et leur utilisation ne présente aucune considération éthique. La mouche des fruits Drosophila melanogaster, par exemple, a fourni d’excellentes informations sur une variété de recherches sur le comportement, le développement, le métabolisme et l’immunité. Plus précisément, les mouches adultes et les larves de D. melanogaster possèdent plusieurs réactions de défense innées qui sont partagées avec les animaux vertébrés. Les mécanismes régulant les réponses immunitaires ont été principalement révélés par des études génétiques et moléculaires dans le modèle de D. melanogaster . Ici, une nouvelle technique d’injection larvaire est fournie, qui favorisera davantage les recherches sur les processus immunitaires innés chez les larves de D. melanogaster et explorera la pathogenèse d’un large éventail d’infections microbiennes.
Introduction
Drosophila melanogaster a été immensément utilisé dans la recherche biologique et biomédicale pendant plusieurs décennies, car la gamme sophistiquée d’outils génétiques et moléculaires a progressivement évolué pour l’analyse d’un large éventail d’études1,2,3,4. Les aspects du développement, de l’homéostasie et de l’immunité innée conservés sur le plan évolutif chez D. melanogaster en ont fait un organisme modèle précieux pour l’étude de diverses maladies humaines et d’insectes5,6. Notamment, le rôle fondamental du modèle de D. melanogaster pour l’étude de l’immunité a été largement illustré dans les études sur les mouches adultes. Cependant, les études sur les larves de D. melanogaster ont également contribué aux connaissances actuelles et ont principalement exploré les réponses immunitaires cellulaires, en particulier pour les infections à guêpes et aux nématodes qui se produisent par la cuticule de l’insecte7,8,9,10. Les larves de Drosophila melanogaster possèdent trois types différents de cellules sanguines, collectivement appelées hémocytes : plasmatocytes, cellules cristallines et lamellocytes11,12,13. Ces cellules peuvent monter un éventail de réponses immunitaires lorsque les larves de D. melanogaster sont infectées par des agents pathogènes tels que des bactéries, des champignons, des virus et des parasites14,15,16. Les réponses immunitaires cellulaires comprennent l’engloutissement direct (phagocytose) de petites molécules ou bactéries, la mélanisation, l’encapsulation d’agents pathogènes plus gros tels que les œufs parasitoïdes et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de synthases d’oxyde nitrique (NOS)17,18,19.
En revanche, moins d’études ont été publiées sur l’utilisation du modèle larvaire de D. melanogaster pour analyser les réponses immunitaires humorales. Cela est principalement dû à l’application de tests d’alimentation pour l’infection orale des larves de D. melanogaster et à plusieurs défis associés à la microinjection des larves, y compris la manipulation précise des larves et l’utilisation appropriée de la micro-aiguille, en particulier pendant la pénétration20,21. Ainsi, la connaissance limitée de l’infection larvaire et les difficultés techniques (c.-à-d. mortalité élevée) ont souvent rendu le modèle larvaire de D. melanogaster difficile à utiliser. Un modèle larvaire aura le potentiel d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires qui fourniront des informations supplémentaires sur les interactions hôte-pathogène et l’induction de réponses immunitaires innées spécifiques de l’hôte contre les infections pathogènes.
Ici, un protocole simple et efficace qui peut être utilisé pour injecter aux larves de D. mélanogasster divers agents pathogènes, tels que des bactéries, est décrit en détail. En particulier, les larves de D. melanogaster sont utilisées pour les injections avec l’agent pathogène humain Photorhabdus asymbiotica et la bactérie non pathogène Escherichia coli. Cette méthode peut être utilisée pour la manipulation et l’analyse des réponses immunitaires de D. melanogaster à diverses infections microbiennes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster est l’un des modèles les plus précieux et les plus manipulés expérimentalement utilisés pour étudier l’immunité innée et la pathogenèse de diverses infections microbiennes. Cela est dû à son cycle de vie simple et rapide, à son entretien simple en laboratoire, à sa génétique évolutive bien établie et à sa boîte à outils génétique diversifiée. Les méthodes antérieures d’injection de larves de D. melanogaster, telles que l’utilisation d’un disposi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington (GWU) pour leur lecture critique du manuscrit. GT a été soutenu par une bourse d’été Harlan de GWU. Toutes les figures graphiques ont été réalisées à l’aide de BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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