Drosophila melanogaster voksne fluer er blevet flittigt brugt som modelorganismer til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for værts antimikrobielle medfødte immunresponser og mikrobielle infektionsstrategier. For at fremme D. melanogaster larvestadiet som et yderligere eller alternativt modelsystem beskrives en larveinjektionsteknik.
Brugen af ukonventionelle modeller til at studere medfødt immunitet og patogen virulens giver et værdifuldt alternativ til pattedyrsmodeller, som kan være dyre og rejse etiske spørgsmål. Ukonventionelle modeller er notorisk billige, nemme at håndtere og kultur og tager ikke meget plads. De er genetisk modtagelige og besidder komplette genomsekvenser, og deres anvendelse giver ingen etiske overvejelser. Bananfluen Drosophila melanogaster har for eksempel givet stor indsigt i en række adfærd, udvikling, stofskifte og immunitetsforskning. Mere specifikt har D. melanogaster voksne fluer og larver flere medfødte forsvarsreaktioner, der deles med hvirveldyr. De mekanismer, der regulerer immunresponser, er for det meste blevet afsløret gennem genetiske og molekylære undersøgelser i D. melanogaster-modellen . Her tilvejebringes en ny larveinjektionsteknik, som yderligere vil fremme undersøgelser af medfødte immunprocesser i D. melanogasterlarver og udforske patogenesen af en lang række mikrobielle infektioner.
Drosophila melanogaster er blevet enormt udnyttet i biologisk og biomedicinsk forskning i flere årtier, da det sofistikerede udvalg af genetiske og molekylære værktøjer støt har udviklet sig til analyse af en bred vifte af undersøgelser1,2,3,4. De evolutionært bevarede aspekter af udvikling, homeostase og medfødt immunitet i D. melanogaster har gjort det til en værdifuld modelorganisme til at studere forskellige sygdomme hos mennesker og insekter5,6. Især er den grundlæggende rolle, som D. melanogaster-modellen spiller for at studere immunitet, stort set blevet eksemplificeret i voksne fluestudier. D. melanogaster larver undersøgelser har imidlertid også bidraget til den nuværende viden og hovedsageligt udforsket cellulære immunresponser, specifikt for hvepse- og nematodeinfektioner, der forekommer gennem insektets kutikle7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver besidder tre forskellige typer blodlegemer, samlet kaldet hæmocytter: plasmatocytter, krystalceller og lamellocytter11,12,13. Disse celler kan montere en række immunresponser, når D. melanogaster larver er inficeret med patogener som bakterier, svampe, vira og parasitter14,15,16. Cellulære immunresponser omfatter direkte opslugning (fagocytose) af små molekyler eller bakterier, melanisering, indkapsling af større patogener såsom parasitoide æg og produktion af reaktive iltarter (ROS) og nitrogenoxidsyntaser (NOS) 17,18,19.
I modsætning hertil er der offentliggjort færre undersøgelser om brugen af D. melanogaster larvemodellen til at analysere humorale immunresponser. Dette skyldes hovedsagelig anvendelsen af fodringsassays til oral infektion af D. melanogasterlarver og flere udfordringer forbundet med mikroinjektion af larver, herunder præcis håndtering af larver og korrekt brug af mikronålen, især under penetration20,21. Således har den begrænsede viden om larveinfektion og tekniske vanskeligheder (dvs. høj dødelighed) ofte gjort D. melanogaster larvemodellen vanskelig at bruge. En larvemodel vil have potentiale til at identificere nye molekylære mekanismer, der vil give yderligere indsigt i værtspatogeninteraktioner og induktion af specifikke værts medfødte immunresponser mod patogene infektioner.
Her beskrives en enkel og effektiv protokol, der kan bruges til at injicere D. melanogaster larver med forskellige patogener, såsom bakterier, detaljeret. Især anvendes D. melanogaster larver til injektioner med det humane patogen Photorhabdus asymbiotica og de ikke-patogene bakterier Escherichia coli. Denne metode kan anvendes til manipulation og analyse af D. melanogasters immunrespons på forskellige mikrobielle infektioner.
Drosophila melanogaster er blandt de mest værdifulde, eksperimentelt manipulerede modeller, der anvendes til undersøgelser af medfødt immunitet og patogenese af forskellige mikrobielle infektioner. Dette skyldes dets enkle og hurtige livscyklus, enkel vedligeholdelse i et laboratorium, veletableret evolutionær genetik og forskelligartet genetisk værktøjskasse. Tidligere metoder til D. melanogaster larver injektioner, såsom at bruge en hybrid mikrofluidisk enhed eller en Narishige micromanipulator…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University (GWU) for kritisk læsning af manuskriptet. GT blev støttet gennem et Harlan sommerstipendium fra GWU. Alle grafiske figurer blev lavet ved hjælp af BioRender.
Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
Prism | GraphPad | Version 8 | |
Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |