דרוסופילה התנהגות הימנעות פסיבית כפרדיגמה חדשה לחקר למידה אסוציאטיבית מרתיעה
Summary
עבודה זו מתארת פרדיגמה התנהגותית פשוטה המאפשרת ניתוח של למידה אסוציאטיבית מרתיעה בזבובי פירות בוגרים. השיטה מבוססת על דיכוי ההתנהגות הגיאוטקסית השלילית המולדת בשל הקשר שנוצר בין הקשר סביבתי מסוים להלם חשמלי.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר פרדיגמה חדשה לניתוח למידה אסוציאטיבית מרתיעה בזבובים בוגרים (Drosophila melanogaster). הפרדיגמה מקבילה להתנהגות הימנעות פסיבית במכרסמים במעבדה שבה בעלי חיים לומדים להימנע מתא שבו הם קיבלו בעבר הלם חשמלי. הבדיקה מנצלת גיאוטקסי שלילי בזבובים, המתבטא כדחף לטפס למעלה כאשר הם ממוקמים על משטח אנכי. ההתקנה מורכבת ממתאים עליונים ותחתונים בעלי כיוון אנכי. בניסוי הראשון, זבוב ממוקם בתא תחתון שממנו הוא יוצא בדרך כלל בטווח של 3-15 שניות, ונכנס לתא העליון שם הוא מקבל הלם חשמלי. במהלך המשפט השני, 24 שעות מאוחר יותר, ההשהיה גדלה באופן משמעותי. יחד עם זאת, מספר הזעזועים יורד בהשוואה לניסוי הראשון, מה שמצביע על כך שזבובים יצרו זיכרון לטווח ארוך על התא העליון. ההקלטות של השהיות ומספר הזעזועים יכולות להתבצע עם מונה ספירה ושעון עצר או עם מכשיר פשוט מבוסס Arduino. כדי להמחיש כיצד ניתן להשתמש בבדיקה, התנהגות ההימנעות הפסיבית של ד’ מלנוגסטר ו – D. simulans זכר ונקבה אופיינו כאן. השוואה של השהיות ומספר זעזועים גילתה כי הן D. melanogaster ו D. simulans זבובים למדו ביעילות את התנהגות ההימנעות הפסיבית. לא נצפו הבדלים סטטיסטיים בין זבובים זכריים ונקביים. עם זאת, הזכרים היו קצת יותר מהירים בעת הכניסה לתא העליון בניסוי הראשון, בעוד הנקבות קיבלו מספר מעט גבוה יותר של זעזועים בכל משפט שמירה. הדיאטה המערבית (WD) פגעה באופן משמעותי בלמידה ובזיכרון בזבובים זכרים בזמן שתרגילי טיסה איזנו את האפקט הזה. יחד, התנהגות ההימנעות הפסיבית בזבובים מציעה בדיקה פשוטה וניתנת לשחזור שיכולה לשמש ללימוד מנגנונים בסיסיים של למידה וזיכרון.
Introduction
למידה וזיכרון הוא מנגנון הסתגלות עתיק אבולוציוני לסביבה, שנשמר מדרוזופילה (D. ) לאנושות1. זבוב הפירות הוא אורגניזם מודל חזק ללמוד עקרונות בסיסיים של למידה וזיכרון כפי שהוא מציע מגוון רחב של כלים גנטיים רבי עוצמה לנתח מנגנונים מולקולריים מהותיים2. מחקרי ההקרנה הגנטית החלוציים, שזיהו גנים rutabaga3, אמנזיה4 ו– dunce5 החיוניים ללמידה ולזיכרון2, ניצלו את ההתניה הריחית כאשר זבובי הפירות מסתמכים על חוש הריח החריף שלהם כדי למצוא מזון, בני זוג פוטנציאליים, ולהימנע מטורפים6.
מיזוג חוש הריח הפך לפרדיגמה פופולרית ללמוד את מנגנון הלמידה והזיכרון, הודות להכנסת חוש הריח T-maze על ידי טולי וקווין 7,8. לאחר מכן, הוצעו שיטות אחרות למדידת סוגים שונים של למידה וזיכרון, כולל התניה חזותית9, מיזוג חיזור10, בדיקת דיכוי פוטוקסי מרתיעה11, ומיזוג חשיפה לצרעות12. עם זאת, לרוב הבדיקות הללו יש התקנה מורכבת שיש לבנות בהתאמה אישית בסדנה באוניברסיטה או לרכוש אותה באמצעות ספק. הפרדיגמה המתוארת כאן מבוססת על בדיקה התנהגותית פשוטה לחקר למידה אסוציאטיבית מרתיעה בזבובים שניתן להרכיב בקלות עם כמה אספקה זמינה.
הפרדיגמה המתוארת שקולה להתנהגות הימנעות פסיבית (או מעכבת) בעכברים וחולדות מעבדה שבה בעלי חיים לומדים להימנע מתא שבו הם קיבלו בעבר הלם רגל חשמלי13. ב murids, ההליך מבוסס על הימנעות מולדתם של אור בהיר והעדפה לאזורים כהים יותר14. בניסוי הראשון, החיה ממוקמת לתוך התא הבהיר, שממנו החיה יוצאת במהירות, צועדת לתוך תא חשוך, שבו הלם רגל חשמלי מועבר. בדרך כלל, ניסיון יחיד מספיק כדי ליצור זיכרון מוצק לטווח ארוך, וכתוצאה מכך השהיה מוגברת באופן משמעותי 24 שעות מאוחר יותר. ההשהיה משמשת לאחר מכן כמדד ליכולתו של בעל החיים לזכור את הקשר בין הגירוי המרתיע לסביבה הספציפית15.
עבודה זו מתארת הליך אנלוגי באמצעות D. כמערכת מודל המציעה מספר יתרונות על פני מודלים מכרסמים כולל עלות-תועלת, גודל מדגם גדול יותר, היעדר פיקוח רגולטורי, וגישה לכלים גנטיים רבי עוצמה16,17. ההליך מבוסס על התנהגות גיאוטקסית שלילית, המתבטאת בדחף של זבובים לטפס למעלה כאשר הם ממוקמים על משטח אנכי18. ההתקנה מורכבת משני תאים אנכיים. בניסוי הראשון, זבוב פירות ממוקם בתא תחתון. משם, הוא בדרך כלל יוצא בתוך 3-15 שניות, נכנס לתא העליון שבו הוא מקבל הלם חשמלי. במהלך ניסוי של דקה אחת, זבובים מסוימים עשויים מדי פעם להיכנס מחדש לתא העליון, מה שגורם להלם חשמלי נוסף. במהלך שלב הבדיקה, 24 שעות מאוחר יותר, ההשהיה גדלה באופן משמעותי. יחד עם זאת, מספר הזעזועים יורד בהשוואה ליום הראשון המציין כי זבובים יצרו זיכרון אסוציאטיבי מרתיע על התא העליון. ההשהיה, מספר הזעזועים, ומשך ותדירות התקפי הטיפוח משמשים לאחר מכן לניתוח התנהגות בעלי החיים והיכולת ליצור ולזכור את הקשר בין הגירוי המרתיע לסביבה הספציפית. התוצאות הייצוגיות מגלות כי חשיפה לתזונה המערבית (WD) פוגעת באופן משמעותי בהתנהגות ההימנעות הפסיבית בזבובים זכרים, דבר המצביע על כך ש-WD משפיע עמוקות על התנהגות הזבוב ועל הקוגניציה שלו. לעומת זאת, תרגיל טיסה הקל על ההשפעה השלילית של WD, ושיפר את התנהגות ההימנעות הפסיבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הימנעות מגירויים מאיימים היא מאפיין מכריע של התנהגות הסתגלותית במינים שונים מ C. אלגנטיות לאדם32. הליכי למידה הימנעות אשר בדרך כלל כרוכים בבריחה של אירוע מרתיע, משמשים בדרך כלל משימות התנהגותיות לחקור תהליכי למידה וזיכרון במכרסמים מעבדה13 מאז 1970 של 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקים על ידי NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
References
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).
