Drosophila Passiv undgåelse adfærd som et nyt paradigme for at studere associativ aversiv læring
Summary
Dette arbejde beskriver et simpelt adfærdsparadigme, der gør det muligt at analysere aversiv associativ læring i voksne frugtfluer. Metoden er baseret på at undertrykke den medfødte negative geotaxis adfærd på grund af sammenhængen dannet mellem en bestemt miljøkontekst og et elektrisk stød.
Abstract
Denne protokol beskriver et nyt paradigme for analyse af aversiv associativ læring i voksne fluer (Drosophila melanogaster). Paradigmet er analogt med passiv undgåelsesadfærd hos laboratorie gnavere, hvor dyr lærer at undgå et rum, hvor de tidligere har fået et elektrisk stød. Analysen udnytter negativ geotaxis i fluer, hvilket manifesterer sig som en trang til at klatre op, når de er placeret på en lodret overflade. Opsætningen består af vertikalt orienterede øvre og nedre rum. På det første forsøg placeres en flue i et lavere rum, hvorfra den normalt kommer ud inden for 3-15 s, og træder ind i det øverste rum, hvor den får elektrisk stød. Under det andet forsøg, 24 timer senere, er ventetiden øget betydeligt. Samtidig reduceres antallet af stød sammenlignet med det første forsøg, hvilket indikerer, at fluer dannede langtidshukommelse om det øverste rum. Optagelserne af latencies og antallet af chok kunne udføres med en tælle tæller og et stopur eller med en Arduino-baseret simpel enhed. For at illustrere, hvordan analysen kan bruges, den passive undgåelse adfærd D. melanogaster og D. simulans mandlige og kvindelige blev karakteriseret her. Sammenligning af latencies og antallet af chok afslørede, at både D. melanogaster og D. simulans fluer effektivt lært passiv undgåelse adfærd. Der blev ikke observeret statistiske forskelle mellem mandlige og kvindelige fluer. Mænd var dog lidt hurtigere, mens de kom ind i det øverste rum på det første forsøg, mens kvinder fik et lidt højere antal chok i hvert fastholdelsesforsøg. Den vestlige kost (WD) betydeligt nedsat læring og hukommelse i mandlige fluer, mens flyvning motion opvejet denne effekt. Samlet set tilbyder passiv undgåelsesadfærd i fluer en enkel og reproducerbar analyse, der kan bruges til at studere grundlæggende mekanismer for læring og hukommelse.
Introduction
Læring og hukommelse er en evolutionært gammel tilpasningsmekanisme til miljøet, bevaret fra Drosophila (D.) til human1. Frugtfluen er en robust modelorganisme til at studere grundlæggende principper for læring og hukommelse, da den tilbyder en bred vifte af kraftfulde genetiske værktøjer til at dissekere iboende molekylære mekanismer2. De banebrydende genetiske screening undersøgelser, som identificerede rutabaga3, hukommelsestab, og dunce5 gener afgørende for læring og hukommelse2, benyttede sig af olfaktoriske konditionering som frugt fluer stole på deres skarpe lugtesans for at finde mad, potentielle hjælpere, og for at undgå rovdyr6.
Olfaktorisk konditionering er blevet et populært paradigme for at studere mekanismen for læring og hukommelse, takket være indførelsen af olfaktorisk T-labyrint af Tully og Quinn7,8. Efterfølgende, andre metoder til at måle forskellige typer af læring og hukommelse er blevet foreslået, herunder visuel konditionering9, frieri conditioning10, aversive phototaxis undertrykkelse assay11, og hveps-eksponering conditioning12. Men de fleste af disse analyser har en kompleks opsætning, der skal specialbygget på et universitetsværksted eller købes gennem en leverandør. Paradigmet beskrevet her er baseret på en simpel adfærdsmæssig analyse for at studere aversiv associativ læring i fluer, der let kan samles med et par tilgængelige forsyninger.
Det beskrevne paradigme svarer til passiv (eller hæmmende) undgåelsesadfærd hos laboratoriemus og rotter, hvor dyr lærer at undgå et rum, hvor de tidligere har fået elektrisk fodchok13. I murids er proceduren baseret på deres medfødte undgåelse af stærkt lys og præference for mørkere områder14. På det første forsøg placeres dyret i det lyse rum, hvorfra dyret hurtigt kommer ud og træder ind i et mørkt rum, hvor der leveres et elektrisk fodchok. Normalt er en enkelt retssag tilstrækkelig til at danne en solid langtidshukommelse, hvilket resulterer i signifikant øget ventetid 24 timer senere. Latenstiden bruges derefter som et indeks over dyrets evne til at huske sammenhængen mellem den aversive stimulus og det specifikke miljø15.
Dette arbejde beskriver en analog procedure ved hjælp af D. som et modelsystem, der giver flere fordele i forhold til gnavermodeller, herunder omkostningseffektivitet, større stikprøvestørrelse, fraværet af myndighedstilsyn og adgang til kraftfulde genetiske værktøjer16,17. Proceduren er baseret på negativ geotaxis adfærd, som manifesterer sig i fluer trang til at klatre op, når de er placeret på en lodret overflade18. Opsætningen består af to lodrette kamre. På det første forsøg placeres en frugtflue i et lavere rum. Derfra går det normalt inden for 3-15 s og træder ind i det øverste rum, hvor det får et elektrisk stød. Under en 1 min forsøg, kan nogle fluer lejlighedsvis genindtræde i det øverste rum, hvilket resulterer i en ekstra elektrisk stød. I testfasen, 24 timer senere, øges ventetiden betydeligt. Samtidig reduceres antallet af chok i forhold til den første dag, hvilket indikerer, at fluer dannede aversiv associativ hukommelse om det øverste rum. Ventetiden, antallet af chok og varigheden og hyppigheden af plejeanfald bruges derefter til at analysere dyrets adfærd og evnen til at danne og huske sammenhængen mellem den aversive stimulus og det specifikke miljø. De repræsentative resultater viser, at eksponering for den vestlige kost (WD) væsentligt forringer passiv undgåelse adfærd i mandlige fluer, hvilket tyder på, at WD dybt påvirker fluens adfærd og kognition. Omvendt, flyvning øvelse lettet den negative effekt af WD, forbedre passiv undgåelse adfærd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undgåelse af truende stimuli er et afgørende kendetegn ved adaptiv adfærd hos forskellige arter fra C. elegance til human32. Undgåelse læringsprocedurer, som typisk indebærer flugt af en aversiv begivenhed, er almindeligt anvendte adfærdsmæssige opgaver til at undersøge læring og hukommelse processer i laboratoriet gnavere13 siden 1970’erne32. I aktive undgåelsesprocedurer efterfølges et ligegyldigt stimulus- eller konditioneret …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet i dele af NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
References
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).
