Drosophila Passivt undvikande beteende som ett nytt paradigm för att studera associativt aversivt lärande
Summary
Detta arbete beskriver ett enkelt beteendeparadigm som tillåter analys av aversiv associativ inlärning hos vuxna fruktflugor. Metoden bygger på att undertrycka det medfödda negativa geotaxisbeteendet på grund av associationen som bildas mellan ett specifikt miljösammanhang och en elektrisk stöt.
Abstract
Detta protokoll beskriver ett nytt paradigm för att analysera aversiv associativ inlärning hos vuxna flugor (Drosophila melanogaster). Paradigmet är analogt med passivt undvikande beteende hos laboratoriegnagare där djur lär sig att undvika ett fack där de tidigare har fått en elektrisk stöt. Analysen drar nytta av negativ geotaxis i flugor, vilket manifesterar sig som en lust att klättra upp när de placeras på en vertikal yta. Installationen består av vertikalt orienterade övre och nedre fack. Vid den första försöket placeras en fluga i ett nedre fack varifrån den vanligtvis går ut inom 3-15 s och kliver in i det övre facket där den får en elektrisk stöt. Under den andra prövningen, 24 timmar senare, ökas latensen avsevärt. Samtidigt minskar antalet chocker jämfört med den första studien, vilket indikerar att flugor bildade långtidsminne om det övre facket. Inspelningar av latenser och antal stötar kan utföras med en räkningsräknare och ett stoppur eller med en Arduino-baserad enkel enhet. För att illustrera hur analysen kan användas, karakteriserades det passiva undvikande beteendet hos D. melanogaster och D. simulaner man och kvinna här. Jämförelse av latenser och antal chocker visade att både D. melanogaster och D. simulaner flyger effektivt lärt sig passiv undvikande beteende. Inga statistiska skillnader observerades mellan manliga och kvinnliga flugor. Män var dock lite snabbare när de gick in i det övre facket på den första studien, medan kvinnor fick ett något högre antal chocker i varje retentionsförsök. Den västerländska kosten (WD) avsevärt försämrade lärande och minne hos manliga flugor medan flygträning uppvägde denna effekt. Sammantaget erbjuder det passiva undvikande beteendet hos flugor en enkel och reproducerbar analys som kan användas för att studera grundläggande mekanismer för lärande och minne.
Introduction
Lärande och minne är en evolutionärt gammal anpassningsmekanism till miljön, bevarad från Drosophila (D.) till människa1. Fruktflugan är en robust modellorganism för att studera grundläggande principer för lärande och minne eftersom den erbjuder ett brett utbud av kraftfulla genetiska verktyg för att dissekera inneboende molekylära mekanismer2. De banbrytande genetiska screeningstudierna, som identifierade rutabaga3-, amnesiac4– och dunce5-gener som är kritiska för lärande och minne2, utnyttjade luktkonditionering eftersom fruktflugorna förlitar sig på sin skarpa luktsinne för att hitta mat, potentiella kompisar och för att undvika rovdjur6.
Luktkonditionering har blivit ett populärt paradigm för att studera mekanismen för lärande och minne, tack vare införandet av lukt t-labyrint av Tully och Quinn7,8. Därefter har andra metoder för att mäta olika typer av lärande och minne föreslagits, inklusive visuell konditionering9, uppvaktningskonditionering10, aversive phototaxis suppression assay11 och wasp-exponering konditionering12. De flesta av dessa analyser har dock en komplex inställning som måste specialbyggas på en universitetsverkstad eller köpas via en leverantör. Paradigmet som beskrivs här är baserat på en enkel beteendeanalys för att studera aversiv associativ inlärning i flugor som enkelt kan monteras med några tillgängliga förnödenheter.
Det beskrivna paradigmet motsvarar passivt (eller hämmande) undvikande beteende hos laboratoriemöss och råttor där djur lär sig att undvika ett fack där de tidigare har fått elektrisk fotchock13. I murids är förfarandet baserat på deras medfödda undvikande av starkt ljus och preferens för mörkare områden14. Vid den första prövningen placeras djuret i det ljusa facket, varifrån djuret snabbt går ut och kliver in i ett mörkt fack, där en elektrisk fotstöt levereras. Vanligtvis är en enda studie tillräcklig för att bilda ett fast långtidsminne, vilket resulterar i betydligt ökad latens 24 h senare. Latensen används sedan som ett index över djurets förmåga att komma ihåg sambandet mellan den aversiva stimulansen och den specifika miljön15.
Detta arbete beskriver ett analogt förfarande med D. som ett modellsystem som erbjuder flera fördelar jämfört med gnagaremodeller inklusive kostnadseffektivitet, större urvalsstorlek, avsaknad av tillsyn och tillgång till kraftfulla genetiska verktyg16,17. Förfarandet är baserat på negativt geotaxisbeteende, vilket manifesterar sig i flugors lust att klättra upp när de placeras på en vertikal yta18. Installationen består av två vertikala kammare. Vid den första försöket placeras en fruktfluga i ett lägre fack. Därifrån går den vanligtvis ut inom 3-15 s och kliver in i det övre facket där den får en elektrisk stöt. Under en 1 min försök kan vissa flugor ibland komma in i det övre facket igen, vilket resulterar i en extra elektrisk stöt. Under test fasen, 24 h senare, ökas svars tiden avsevärt. Samtidigt minskar antalet chocker jämfört med den första dagen som indikerar att flugor bildade aversivt associativt minne om det övre facket. Latensen, antalet chocker och varaktigheten och frekvensen av grooming bouts används sedan för att analysera djurets beteende och förmågan att bilda och komma ihåg sambandet mellan den aversiva stimulansen och den specifika miljön. De representativa resultaten visar att exponering för den västerländska kosten (WD) avsevärt försämrar passivt undvikande beteende hos manliga flugor, vilket tyder på att WD djupt påverkar flugans beteende och kognition. Omvänt lindrade flygövning den negativa effekten av WD, vilket förbättrade passivt undvikande beteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undvikande av hotande stimuli är en avgörande egenskap hos adaptivt beteende hos olika arter från C. elegans till human32. Undvikande inlärningsförfaranden som vanligtvis innebär att fly från en aversiv händelse, används ofta beteendemässiga uppgifter för att undersöka inlärnings- och minnesprocesser hos laboratoriegnagare13 sedan 1970-talet32. I aktiva undvikande förfaranden följs en likgiltig stimulans eller betingad signal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes delvis av NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
References
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).
