Chromatographie ultra-haute performance semi-ciblée couplée à l’analyse par spectrométrie de masse des métabolites phénoliques dans le plasma des adultes âgés
Summary
L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma à l’aide d’une méthode de chromatographie-spectrométrie de masse semi-ciblée.
Abstract
Un groupe de 23 personnes âgées a reçu des repas fonctionnels (une boisson et un muffin) spécialement formulés pour la prévention de la sarcopénie (perte de masse musculaire liée à l’âge). Des échantillons de plasma ont été prélevés au début de l’intervention et après 30 jours de consommation des repas fonctionnels. Une chromatographie semi-ciblée à ultra-haute performance couplée à une analyse de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été réalisée pour identifier les composés phénoliques et leurs métabolites. Les protéines plasmatiques ont été précipitées avec de l’éthanol et les échantillons ont été concentrés et remis en suspension dans la phase mobile (acétonitrile 1:1 : eau) avant injection dans l’instrument UPLC-MS/MS. La séparation a été réalisée avec une colonne de phase inverse en C18 , et les composés ont été identifiés à l’aide de leur masse expérimentale, de leur distribution isotopique et de leur motif de fragment. Les composés d’intérêt ont été comparés à ceux des banques de données et de la bibliothèque interne semi-ciblée. Les résultats préliminaires ont montré que les principaux métabolites identifiés après l’intervention étaient l’acide phénylacétique, la glycitine, l’acide 3-hydroxyphénylvalérique et la gomisine M2.
Introduction
La sarcopénie est un trouble squelettique progressif lié à une perte musculaire accélérée chez la population âgée. Cette condition augmente le risque de chutes et conduit à des activités limitées de la vie quotidienne. La sarcopénie est présente chez environ 5 % à 10 % des personnes de plus de 65 ans et environ 50 % des personnes âgées de 80 ans ou plus1. Aucun médicament spécifique n’a été approuvé pour le traitement de la sarcopénie, il est donc important de prévenir par l’activité physique et une alimentation équilibrée1,2. Les interventions nutritionnelles avec des aliments spécialement formulés enrichis en protéines laitières et en acides aminés essentiels ont montré des résultats positifs dans la prévention de la sarcopénie2. Dans d’autres études, les auteurs ont inclus des vitamines et des antioxydants, comme la vitamine E et les isoflavones, dans l’alimentation, augmentant ainsi les avantages pour le gain musculaire à la taille et aux hanches3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) est un arbre qui pousse dans les régions tropicales mexicaines; il a été consommé par les cultures mayas en raison de sa haute valeur nutritionnelle4. C’est une bonne source de protéines, de fibres, de minéraux et d’antioxydants phénoliques, tels que l’acide chlorogénique5. Comme elle peut être moulue en poudre et utilisée dans les produits de boulangerie ou consommée dans les boissons, des études récentes ont évalué l’incorporation de farine de graines de Ramón (RSF) dans différents aliments pour améliorer leur valeur nutritionnelle. Une boisson aromatisée au cappuccino supplémentée par RSF a été formulée, qui était riche en fibres alimentaires et contenait plus de 6 g de protéines par portion, et était très acceptée par les consommateurs; il a donc été considéré comme une solution de rechange potentielle pour répondre à des besoins alimentaires particuliers6. Dans une étude de suivi, RSF a également été utilisé pour formuler un muffin et une nouvelle boisson riche en protéines, fibres alimentaires, micronutriments et antioxydants phénoliques. Le muffin et la boisson ont été utilisés dans une intervention diététique pour les personnes âgées, qui ont consommé les deux produits deux fois par jour pendant 30 jours. Après cette période, l’état nutritionnel et sarcopénique des participants s’est amélioré et la teneur totale en phénol du plasma a augmenté7. Cependant, la détermination des composés phénoliques totaux dans le plasma a été effectuée par une méthode spectrophotométrique, de sorte qu’il n’a pas été possible d’identifier les composés phénoliques réels qui ont été absorbés; de plus, cette méthode n’est pas complètement spécifique pour les composés phénoliques, de sorte qu’une certaine surestimation peut se produire8.
L’identification et la quantification des composés phénoliques qui sont absorbés après la consommation d’aliments riches en ces antioxydants est une tâche difficile mais nécessaire pour démontrer l’activité biologique de ces composés phytochimiques. La biodisponibilité de la plupart des composés phénoliques est faible; moins de 5% d’entre eux peuvent être trouvés sans transformation structurelle dans le plasma. Les composés phénoliques subissent plusieurs biotransformations, telles que la méthylation, la sulfonation ou la glucuronidation, qui sont effectuées par les entérocytes et les hépatocytes9. Les composés phénoliques sont également biotransformés par le microbiote en catabolites bactériens qui peuvent exercer leurs effets bénéfiques dans le corps après avoir été absorbés dans le plasma10. Par exemple, l’acide phénylacétique est un produit de la transformation bactérienne des flavonoïdes et des proanthocyanidines oligomères, qui peuvent inhiber jusqu’à 40% de l’adhésion des bactéries (Escherichia coli) dans les voies urinaires après la consommation de canneberges11.
La diversité structurelle des composés phénoliques naturels, ajoutée à la diversité de leurs métabolites et à leur faible biodisponibilité, rend leur identification dans le plasma encore plus difficile. Le profilage métabolomique, utilisant des plateformes d’analyse spectroscopique comme la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectroscopie de masse en tandem (MS/MS), est probablement la meilleure approche pour atteindre cet objectif; malheureusement, l’équipement n’est pas facilement accessible et le développement de protocoles d’analyse est encore limité12. Plusieurs études ont rapporté que la SEP/SEP couplée à un système de séparation (comme la chromatographie liquide) comme stratégie pour réduire la complexité des spectres de masse dans les études métabolomiques. L’introduction récente de méthodes de séparation par chromatographie liquide à ultra-haute performance (UPLC) a réduit le temps d’analyse et augmenté la résolution et la sensibilité par rapport aux protocoles liquides conventionnels à haute performance, de sorte que les systèmes UPLC-MS/MS ont rapidement été largement acceptés par la communauté de la métabolomique analytique13. De cette façon, certaines études ont étudié les métabolites phénoliques et détecté des dérivés glucuronidés de l’acide caféique, de la quercétine et de l’acide férulique, ainsi que des dérivés sulfonés de l’acide syringique et vanillique dans le plasma des individus après la consommation de canneberge14. Les protocoles précédents visaient à trouver des composés phénoliques et des métabolites phénoliques dans des biofluides tels que le plasma. Ces protocoles étaient basés sur l’identification et la quantification par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) couplée à un détecteur UV-vis15. Néanmoins, de tels protocoles exigent l’utilisation de normes authentiques pour évaluer l’identification absolue et la quantification précise. Un large éventail d’études ont identifié les métabolites les plus courants dans les biofluides (formes sulfonées, glucuronidées et méthylées) par UPLC-MS et UPLC-MS/MS; toutefois, une grande partie des métabolites bactériens n’a pas été signalée en raison du manque de bases de données contenant leurs informations complètes16. L’identification des métabolites est compliquée par le coût et la disponibilité commerciale des étalons de métabolites. Par conséquent, la meilleure stratégie peut être l’analyse non ciblée ou semi-ciblée des métabolites MS/MS, qui repose sur l’utilisation d’informations sur les caractéristiques moléculaires (m/z, masse exacte monoisotopique, distribution isotopique et modèle de fragmentation) pour déterminer l’identité chimique et la comparer à des bases de données en ligne disponibles gratuitement qui contiennent des métabolites polyphénoliques identifiés dans les biofluides après la consommation de polypolyphénols riches12 . Les bases de données les plus importantes utilisées dans les études UPLC-MS/MS pour l’identification des composés phénoliques et de leurs métabolites sont la human Metabolome Database (HMDB), la LipidBlast Library, la METLIN Library et d’autres bases de données complémentaires, telles que PubChem, ChemSpider et Phenol Explorer17.
Dans la présente étude, une méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS a été mise au point pour analyser les échantillons de plasma du groupe de personnes âgées participant à l’étude sur la consommation de muffins et de boissons contenant du RSF7. Les données de différentes bases de données en ligne gratuites sur les métabolites plasmatiques ont été recueillies et intégrées dans une base de données spécialisée. Cette base de données est accessible automatiquement par le logiciel de l’équipement pour identifier les métabolites polyphénoliques dans les cinq échantillons de plasma avant et après l’intervention nutritionnelle de 30 jours. Ceci est fait pour identifier les principaux composés phénoliques, ou leurs métabolites, qui sont absorbés par les aliments fonctionnels spécialement formulés conçus pour la prévention de la sarcopénie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’identification et la quantification des composés phytochimiques bioactifs qui sont absorbés après la consommation d’un aliment ou d’un complément alimentaire sont cruciales pour démontrer et comprendre les bienfaits pour la santé de ces composés et des aliments qui en contiennent. Dans le présent travail, la méthode UPLC-MS/MS a été développée, visant uniquement à identifier les principaux composés phénoliques et leurs métabolites qui ont augmenté en concentration dans le plasma après une inter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants du soutien financier de CONACYT, Mexique (CB- 2016-01-286449), et UACJ-PIVA (Projets 313-17-16 et 335-18-13). L’OAMB tient à remercier CONACYT pour sa bourse de doctorat. Le soutien technique du bureau de production multimédia de l’UACJ est reconnu avec gratitude.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
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