Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

Summary

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Abstract

Enquanto o peixe-zebra tem uma capacidade superior de regenerar seu sistema nervoso central (SNC), o medaka tem uma menor capacidade regenerativa do SNC. Um modelo de lesão cerebral foi desenvolvido no tecto óptico adulto de zebrafish e medaka e análises histológicas e moleculares comparativas foram realizadas para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a alta capacidade regenerativa deste tecido entre essas espécies de peixes. Aqui é apresentado um modelo de lesão por arma branca para o tecto óptico adulto usando agulha e análises histológicas para proliferação e diferenciação das células-tronco neurais (NSCs). Uma agulha foi inserida manualmente na região central do tecto óptico e, em seguida, os peixes foram perfundidos intracárdicos e seus cérebros dissecados. Esses tecidos foram então criossecados e avaliados por imunomarcação contra os marcadores apropriados de proliferação e diferenciação do NSC. Este modelo de lesão tectum fornece resultados robustos e reprodutíveis tanto em zebrafish quanto em medaka, permitindo comparar as respostas do NSC após a lesão. Este método está disponível para pequenos teleósteos, incluindo zebrafish, medaka e killifish africano, e nos permite comparar sua capacidade regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) tem maior capacidade de regeneração do sistema nervoso central (SNC) quando comparado a outros mamíferos ^1,2,3. Recentemente, para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esse aumento da capacidade regenerativa, análises comparativas da regeneração tecidual utilizando tecnologia de sequenciamento de última geração têm sido^{realizadas4,5,6}. As estruturas cerebrais do peixe-zebra e dos tetrápodes são bastante diferentes ^7,8,9. Isso significa que vários modelos de lesão cerebral usando peixes pequenos com estruturas cerebrais e características biológicas semelhantes foram desenvolvidos para facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes que contribuem para esse aumento da capacidade regenerativa.

Além disso, o medaka (Oryzias latipes) é um animal de laboratório popular com baixa capacidade de regeneração cardíaca e neuronal^10,11,12,13 em comparação com o peixe-zebra. Zebrafish e medaka têm estruturas cerebrais e nichos semelhantes para células-tronco neurais adultas (NSCs)^14,15,16,17. Em zebrafish e medaka, o tecto óptico inclui dois tipos de NSCs, células-tronco neuroepiteliais e células gliais radiais (RGCs)^15,18. Uma lesão por arma branca no tecto óptico de zebrafish adultos foi previamente desenvolvida, e este modelo foi usado para investigar os mecanismos moleculares que regulam a regeneração cerebral nesses animais 19,20,21,22,23. Este modelo de lesão por arma branca induziu neurogênese regenerativa a partir de CGRs 19,24,25. Esta lesão por arma branca no tecto óptico é um método robusto e reprodutível13,19,20,21,22,23,24,25. Quando o mesmo modelo de lesão foi aplicado ao medaka adulto, a baixa capacidade neurogênica dos CGRs no tecto óptico de medaka foi revelada através da análise comparativa da proliferação e diferenciação do CGR após a^lesão13.

Modelos de lesão por arma branca no tecto óptico também foram desenvolvidos em modelos de mummichog²⁶, mas detalhes da lesão tectômica não foram bem documentados quando comparados com lesão telencálica²⁷. A lesão por arma branca no tecto óptico utilizando zebrafish e medaka permite a investigação das respostas celulares diferenciais e expressão gênica entre espécies com capacidade regenerativa diferencial. Este protocolo descreve como realizar uma lesão por arma branca no tecto óptico usando uma agulha de injeção. Este método pode ser aplicado a pequenos peixes como zebrafish e medaka. Os processos de preparação de amostras para análise histológica e análise de proliferação e diferenciação celular usando imunohistoquímica fluorescente e criossecções são explicados aqui.

Protocol

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada. Zebrafish e medaka foram mantidos de acordo com procedimentos padronizados28. 1. Ferimento por arma branca no tecto óptico adulto Preparar uma solução estoque de tricaína a 0,4% (p/v) para anestesia. Para uma solução-mãe de 100 ml, dissolver 400 mg de metanossulfon…

Representative Results

A lesão por arma branca no tecto óptico com inserção de agulha no hemisfério direito (Figura 1, Figura 4A e Figura 5A) induz várias respostas celulares, incluindo a proliferação de células gliais radiais (CGR) e a geração de neurônios recém-nascidos. Similarmente, populações envelhecidas de zebrafish e medaka foram usadas para neutralizar quaisquer efeitos do envelhecimento na resposta regenerativa. Em seguida, foi re…

Discussion

Descreve-se aqui um conjunto de métodos que podem ser utilizados para induzir lesões por arma branca no tecto óptico, utilizando uma agulha para facilitar a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A facada mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado que pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. Modelos de lesão por arma branca para várias regiões do cérebro do peixe-zebra foram desenvolvidos<sup clas…

Materials

10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250