Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit
Summary
Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.
Abstract
Während Zebrafische eine überlegene Fähigkeit haben, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren, hat Medaka eine geringere ZNS-Regenerationsfähigkeit. Es wurde ein Hirnverletzungsmodell im adulten optischen Tectum von Zebrafischen und Medaka entwickelt und vergleichende histologische und molekulare Analysen wurden durchgeführt, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die hohe Regenerationsfähigkeit dieses Gewebes bei diesen Fischarten regulieren. Hier wird ein Stichwundenmodell für das adulte optische Tectum unter Verwendung einer Nadel und histologischer Analysen zur Proliferation und Differenzierung der neuralen Stammzellen (NSCs) vorgestellt. Eine Nadel wurde manuell in den zentralen Bereich des optischen Tectums eingeführt, und dann wurden die Fische intrakardial perfundiert und ihre Gehirne wurden seziert. Diese Gewebe wurden dann kryosektioniert und mittels Immunfärbung gegen die entsprechenden NSC-Proliferations- und Differenzierungsmarker bewertet. Dieses Tectum-Verletzungsmodell liefert robuste und reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka, so dass die NSC-Reaktionen nach einer Verletzung verglichen werden können. Diese Methode ist für kleine Teleosten wie Zebrafische, Medaka und afrikanische Killifische verfügbar und ermöglicht es uns, ihre Regenerationsfähigkeit zu vergleichen und einzigartige molekulare Mechanismen zu untersuchen.
Introduction
Zebrafische (Danio rerio) haben im Vergleich zu anderen Säugetieren eine erhöhte Fähigkeit, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren 1,2,3. Um die molekularen Mechanismen, die dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit zugrunde liegen, besser zu verstehen, wurden kürzlich vergleichende Analysen der Geweberegeneration mit Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt 4,5,6. Die Gehirnstrukturen bei Zebrafischen und Tetrapoden sind sehr unterschiedlich 7,8,9. Dies bedeutet, dass mehrere Hirnverletzungsmodelle mit kleinen Fischen mit ähnlichen Gehirnstrukturen und biologischen Merkmalen entwickelt wurden, um die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erleichtern, die zu dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit beitragen.
Darüber hinaus ist Medaka (Oryzias latipes) ein beliebtes Labortier mit einer geringen Kapazität für die Herz- und neuronale Regeneration10,11,12,13 im Vergleich zu Zebrafischen. Zebrafische und Medaka haben ähnliche Gehirnstrukturen und Nischen für adulte neurale Stammzellen (NSCs)14,15,16,17. Im Zebrafisch und in der Medaka umfasst das optische Tectum zwei Arten von NSCs, neuroepithelähnliche Stammzellen und radiale Gliazellen (RGCs)15,18. Eine Stichwundenverletzung für das optische Tectum von erwachsenen Zebrafischen wurde zuvor entwickelt, und dieses Modell wurde verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Gehirnregeneration bei diesen Tieren regulieren 19,20,21,22,23. Dieses junge, erwachsene Zebrafisch-Stichverletzungsmodell induzierte eine regenerative Neurogenese aus RGCs 19,24,25. Diese Stichwundenverletzung im optischen Tectum ist eine robuste und reproduzierbare Methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Wenn das gleiche Verletzungsmodell auf adulte Medaka angewendet wurde, wurde die geringe neurogene Kapazität von RGCs im Medaka Optic Tectum durch die vergleichende Analyse der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach der Verletzung13 aufgedeckt.
Stichwundenverletzungsmodelle im optischen Tectum wurden auch in Mummichog-Modellen26 entwickelt, aber Details der Tectumverletzung wurden im Vergleich zur telenzephalen Verletzung27 nicht gut dokumentiert. Die Stichwundenverletzung im optischen Tectum mit Zebrafisch und Medaka ermöglicht die Untersuchung der differentiellen zellulären Reaktionen und der Genexpression zwischen Arten mit unterschiedlicher Regenerationsfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Stichwunde im optischen Tectum mit einer Injektionsnadel durchgeführt wird. Diese Methode kann auf kleine Fische wie Zebrafische und Medaka angewendet werden. Die Verfahren zur Probenvorbereitung für die histologische Analyse und die zelluläre Proliferations- und Differenzierungsanalyse mittels fluoreszierender Immunhistochemie und Kryosektionen werden hier erläutert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die verwendet werden können, um Stichwundverletzungen im optischen Tectum unter Verwendung einer Nadel zu induzieren, um die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach einer Hirnverletzung zu erleichtern. Nadelvermittelte Stichwunden sind eine einfache, effizient implementierte Methode, die mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden kann. Es wurden Stichwundenmodelle für verschiedene Regionen des Zebrafischgehir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 und 21K15195 sowie ein internes Stipendium des AIST, Japan, unterstützt.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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