Abilità microchirurgiche di stabilire la cannulazione permanente della vena giugulare nei ratti per il campionamento seriale del sangue del farmaco somministrato per via orale
Summary
Tecniche microchirurgiche dettagliate sono dimostrate per stabilire un modello di ratto di cannulazione della vena giugulare a lungo termine per la raccolta sequenziale del sangue nello stesso animale. I parametri fisiologici ed ematologici sono stati monitorati durante la fase di recupero del ratto. Questo modello è stato applicato per studiare la farmacocinetica del polifenolo somministrato per via orale senza indurre stress animale.
Abstract
Il prelievo di sangue in piccoli animali da laboratorio è necessario per l’ottimizzazione del piombo farmaceutico, ma può causare gravi danni e stress agli animali da esperimento, che potrebbero potenzialmente influenzare i risultati. La cannulazione venosa giugulare (JVC) nei ratti è un modello ampiamente utilizzato per la raccolta ripetuta di sangue, ma richiede un’adeguata formazione delle abilità chirurgiche e della cura degli animali. Questo articolo descrive in dettaglio le procedure microchirurgiche per stabilire e mantenere un modello di ratto JVC permanente con particolare attenzione al posizionamento e alla sigillatura della cannula giugulare. L’importanza del monitoraggio dei parametri fisiologici (ad esempio, peso corporeo, cibo e assunzione di acqua) ed ematologici, è stata evidenziata con risultati presentati per 6 giorni dopo l’intervento chirurgico durante il recupero del ratto. Il profilo farmaco-concentrazione plasmatica-tempo dell’acido fenolo ellagico naturale somministrato per via orale è stato determinato nel modello di ratto JVC.
Introduction
L’acquisizione ripetuta di campioni di sangue da piccoli animali da laboratorio, come roditori, porcellini d’India e conigli, è un aspetto importante per l’ottimizzazione del piombo farmaceutico e anche per ridurre il numero di animali utilizzati nella ricerca 1,2. La pipeline per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e la formulazione di farmaci (ad esempio, vaccino) richiede l’accesso a diversi volumi di sangue al fine di valutarne la robustezza e le prestazioni in vivo, come la farmacocinetica (PK), la tossicità e la sensibilità 3,4,5.
L’approccio di laboratorio alla raccolta di campioni di sangue è ampiamente classificato in due tipi, chirurgico e non chirurgico6. L’approccio non chirurgico è relativamente facile da afferrare per il ricercatore, che include tecniche comuni, come la puntura cardiaca, la puntura del seno orbitale e il sanguinamento della vena safena e della coda. Il prelievo di sangue multiplo è possibile con alcuni metodi non chirurgici, ma il volume del campione è piccolo e può causare ferite fisiche e stress psicologico agli animali1. D’altra parte, l’approccio chirurgico è un’alternativa preferita alla venipuntura ripetuta e comporta il posizionamento di una cannula temporanea o permanente nei vasi sanguigni degli animali 7,8,9. Il grande volume di sangue potrebbe essere ripetutamente prelevato attraverso la cannula nei ratti coscienti evitando lo stress e il dolore dovuti alla tecnica di manipolazione, alla trattenuta e all’anestesia 7,8,10,11. Tuttavia, l’impianto della cannula richiede un ricercatore esperto con una formazione adeguata per raccogliere con successo il sangue.
La raccolta di sangue attraverso la cannulazione venosa giugulare (JVC) nei ratti è il metodo più utilizzato per studiare il farmaco PK 6,10,12,13. Tuttavia, l’istituzione del modello di ratto JVC richiede un’attenta pratica delle abilità microchirurgiche e la conoscenza della cura e della manutenzione postchirurgica. Soprattutto, dopo l’intervento chirurgico, il ratto richiede la somministrazione di analgesici e un tempo di recupero sufficiente per raggiungere condizioni fisiologiche stabili per ulteriori esperimenti 13,14,15. Sebbene l’aumento di peso corporeo (cioè >10 g) sia un indicatore valido e comunemente applicato per il recupero del ratto, non è raro che i ratti abbiano una morte inaspettata postoperatoria a causa di disidratazione, infezione e infiammazione, che potrebbe essere sottile da notareall’esordio precoce 14,15. Inoltre, l’ostruzione del catetere nel modello JVC rimane un problema durante la raccolta del sangue.
Il presente protocollo ha dimostrato in dettaglio le procedure microchirurgiche per JVC in un ratto anestetizzato con particolare attenzione all’identificazione, all’isolamento e alla cannulazione della vena giugulare. Viene evidenziata l’importanza del monitoraggio fisiologico ed ematologico dei ratti durante la fase di recupero. Infine, sono stati raccolti campioni di sangue seriale attraverso il catetere venoso per studiare la PK dell’acido fenolo ellagico naturale somministrato per via orale con scarsa biodisponibilità (cioè bassa concentrazione sistemica) per verificare il modello di ratto JVC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Padroneggiare la tecnica della cannulazione dei vasi richiede una pratica significativa e l’apprendimento della lezione da ogni operazione. Christakis et al. utilizzando l’analisi della somma cumulativa (CUSUM), hanno scoperto che un ricercatore deve praticare 200 ratti per un periodo di un anno prima di essere pronto per la valutazione PK dei farmaci candidati20. Tuttavia, il tempo operativo richiesto per la cannulazione venosa può essere significativamente ridotto dal numero di ratti eseguiti<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82003692) a R.X. Zhang; La migliore borsa di studio accademica presso la Northwestern Polytechnical University a R. Miao.
Materials
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | 기타 | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats – A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al. Clinical pharmacokinetics of meloxicam. Arzneimittel-Forschung/Drug Research. 47 (3), 253-258 (1997).
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 ‘-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
