RNA 무결성을 유지하면서 개별 세그먼트의 수집을 허용하는 마우스 배반의 미세 절제 방법이 제시된다. 또한, 비효소 성 배관 세포 해리 절차가 설명된다. 이 방법은 기능적으로 상이한 배반 분과 및 해리된 배관 세포의 후속 유전자 및 단백질 분석에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
마우스 모델 시스템은 유전적 절만성과 실험 적 치료의 저렴한 비용으로 인해 질병 프로세스의 분석에 대한 타의 추종을 불허합니다. 그러나, 그들의 작은 체내에서, 200-400 μm의 직경을 가진 oviduct와 같은 몇몇 구조물은 면역작용화학을 제외하고는 연구하기 상대적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 최근, 면역히토화학 연구는 이전에 인식된 것보다 oviduct 세그먼트에 있는 더 복잡한 다름을 발견했습니다; 따라서, oviduct는 7개의 명백한 상피 세포 모형의 상이한 비율을 가진 4개의 기능적인 세그먼트로 분할됩니다. 상피 세포 모형의 상이한 배아 기원 및 비율은 가능성이 4개의 기능적인 지구가 질병에 분화하기 쉽게 만듭니다. 예를 들어, 전구체 병변은 마우스 모델의 농가 에서 발생하며 인간 나팔관의 상응하는 피모브리알 영역에서 발생한다. 여기서 설명된 프로토콜은 역전사-정량PCR(RT-qPCR) 및 RNA 시퀀싱(RNAseq)과 같은 다운스트림 분석에 필요한 RNA의 충분한 양및 순도를 산출하는 방식으로 마이크로절이 배관을 세분화하는 방법을 상세히 기술한다. 또한 완전히 분화된 난관 세포의 유동 세포측정 또는 단일 세포 RNAeq 분석에 적합한 대부분 비 효소 조직 해리 방법이 기재되어 있다. 설명된 방법은 생식, 불임, 암 및 면역학 분야에서 뮤린 배관을 활용하는 추가 연구를 촉진할 것입니다.
서론
뮤린 배관은 인간 나팔관1과 기능 및 형태학에서 유사합니다. 둘 다 역사적으로 설명된 두 개의 상피 상피 상피 세포로 구성된 의사 섬광 상부로 구성됩니다: 양모 세포 및 분비 세포1,2. oviduct는 세 가지 고전적으로 인식 세그먼트가 있습니다 : fundibulum, 암풀라, 그리고 isthmus. 최근 연구에서, 하와카르 외. 3 7개의 명백한 인구로 상피 세포의 분류의 확장으로 이끌어 내는 oviduct 형태학 및 유전자 발현을 조사했습니다. 또한, 그들은 oviduct3의 뚜렷한 세그먼트로 ampullary-isthmus 접합을 설립했다. 본 명세서에서 기재된 방법은, 농가, 암풀라 및 isthmus에 초점을 맞추고, ampullary-isthmic 접합뿐만 아니라 2,3을 포함하도록 쉽게 확장될 수 있었다. 기금 부족 영역은 오시덕트의 오스티움 또는 개방을 포함하고 있으며, 근접 줄기뿐만 아니라 피모브리알 영역을 포함한다. 자궁쪽....
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프로토콜
모든 동물 취급 및 절차는 캘리포니아 대학, 리버사이드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되고 실험실 동물 관리를 위한 미국 협회, 미국 농무부 및 건강의 국가 학회에서 지침에 따라 이었습니다. 설명된 방법은 C57BL/6 성인, 여성 마우스를 활용하였다. 모든 동물은 조직 수확 전에 참수에 의해 안락사되었다.
참고: 파란색 염료를 사용하여 배반의 효율적인 해부 및 코일링을 지원하는 프로토콜에 대한 개요가 첫 번째 그림(그림 1)에 표시됩니다.
그림 1: 미세 절제 방법의 개요입니다. (A
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결과
설명된 해리 프로토콜은 두 oviducts의 풀링으로 마우스 당 100,000-120,000 세포를 산출합니다. 이 방법은 다중 모액 세포 테두리를 그대로 두고 다중 모액 세포와 분비 세포를 구별할 수 있게 하고 소화 방법이 탈분화를 방지할 만큼 충분히 부드럽다는 것을 확인할 수 있을 만큼 부드럽습니다. 도 5의 대표적인 면역불성 이미지는 4.2.1 단계 다음 의 작은 세포 덩어리를 나타내며, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)/ DPBS에서 3 분 동안 고정되어 1 % 소 세럼 알부민 (BSA)/ 트리스 버퍼링 식염수 -tween (BTBST)로 세척및 정지에 얼룩이 있습니다. 간단히, 세포는 0.5% TritonX-100/BTBST에서 실온에서 15분 동안 투약되었고, BTBST에서 20m 글리신/DPBS에서 실온에서 2시간 동안 배경 형광을 위해 담금질한 다음, BTBST에서 세척한 다음, 5% BSAA/TBSTXXX의 실내 온도에서 1시간 동안 차단하였다. 세포는 B.......
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토론
oviduct의 세 세그먼트는 조직학적으로, 형태학적으로, 및 기능적으로 구별1,2,3이다. 상피는 oviduct의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 크게 다릅니다. Ciliated 세포는 fimbrial/fundibular 끝에 지배, 분비 세포는 isthmic 지역에서 지배 하는 동안1. 이 전반적인 그라데이션은 한동안 인정되었지만, 최근 연구는 oviductal 세그먼트 중 더 많은 구별을 발견했습니다. 따라서, 모온 세포가 관의 근위쪽 끝으로 덜 빈번해지는 동안, 암풀라에서 암풀리-isthmic 접합3로 이동하는 그들의 수(약 60%에서 10% ciliation)의 급격한 하락이 있다3. 또한, 근위 및 탈산 세그먼트에서 상피 세포 집단은 발달적으로 구별되는 계보
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425)에 대한 DoD 획기적인 상에 의해 부분적으로 지원되었다. KCR은 교내 펠로우십에 의해 부분적으로 지원되었다: Pease 암 전 박사 과정 펠로우십과 메리 갈빈 부담 생물 의학 과학 및 캘리포니아 대학, 리버 사이드, 교내 상에서 박사 전 펠로우십: 대학원 위원회 펠러십 위원회 논문 연구 보조금 및 대학원 부문 논문 연도 프로그램 상. 저자는 길리안 M. 라이트와 알리사 M. 쿠마리에게 이 방법의 초기 문제 해결에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5mm 스테인리스강 비드 믹스 | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60mm 멸균 페트리 접시 | Corning | 430166 | |
| 70 μ m 세포 메쉬 | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| 애질런트 진핵 생물 총 RNA 6000 피코 칩 키트 | 애질런트 2100 생물 분석기 | 5067-1513 | |
| 비드 총알 블렌더 조직 균질화 기 | 다음 사전 | BBY24M | |
| Bioanlyzer | 애질런트 2100 생물 분석기 | ||
| 소 혈청 알부민 | 시그마 Aldrich | A7906 | |
| 감기 플레이트/팩/선택한 표면 | N/A | N/A | -20 °으로 유지; C 해부용 |
| 치과 왁스 | Polysciences Inc. | 403 | |
| 둘베코 의 변형된 독수리' s 미디엄 (DMEM)/햄 ' s F12 | Corning | 10-090-CV | 해부 매체 준비: DMEM/ Ham' s F12, 10% FBS, 25mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| 선택한 미세 포인트 겸자 | N/A | /A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| 염소 항-마우스 IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| 염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| 도립 복합 현미경 | Keyence BZ-X700 | ||
| 마우스 안티 마우스 Occludin | Invitrogen | 33-1500 | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| 비효소 해리 완충액 | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L 포도당, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| 나일론 매크로 메쉬 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma Aldrich | P-6148 | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade | Reagent Cell Signaling Technologies | 9071S | 면역세포화학적 검증 이미지: 페이드 방지 마운팅 배지 |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | 프로나제 분해 배지 준비: DMEM/Ham의 F12에서 0.15% 프로나제, 멸균 |
| 프로피듐 요오드 | Roche | 11 348 639 001 | 생존력 검증 이미지 |
| 토끼 안티 마우스 아세틸화-튜불린 | Abcam | ab179484 | 면역세포화학 검증 이미지 |
| RBC 용해 완충액 | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | 텍스트의 온컬럼 정제에 활용 |
| 스프링 형태 현미해부 가위 | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| 멸균 3mL 전구 피펫터 | Globe Scientific | 137135 | |
| 톨루이딘 블루 | Alfa Aesar | J66015 | 준비 톨루이딘 블루 용액 : 1X DPBS, 멸균 |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N / A | / A | 면역 세포 화학 검증 이미지; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 % 트윈 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | 면역세포화학적 검증 이미지 |
| Trizol RNA 추출 시약 | Invitrogen | 15596026 | RNA 추출 시약이라고 합니다. Nucelase-free 물, 클로로포름 및 이소프로포날은 제조업체의 지침에 따라 Trizol 추출을 수행하기 위해 필요합니다 |
참고문헌
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cell....
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