Viene presentato un metodo per la microdissezione dell’ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l’integrità dell’RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.
I sistemi di modelli murini non hanno eguali per l’analisi dei processi patologici a causa della loro manipolabilità genetica e del basso costo dei trattamenti sperimentali. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni corporee, alcune strutture, come l’ovidotto con un diametro di 200-400 μm, si sono dimostrate relativamente difficili da studiare se non con l’immunoistochimica. Recentemente, studi immunoistochimici hanno scoperto differenze più complesse nei segmenti dell’ovidotto di quanto precedentemente riconosciuto; quindi, l’ovidotto è diviso in quattro segmenti funzionali con rapporti diversi di sette distinti tipi di cellule epiteliali. Le diverse origini embriologiche e i rapporti dei tipi di cellule epiteliali probabilmente rendono le quattro regioni funzionali differenzialmente suscettibili alle malattie. Ad esempio, le lesioni precursori dei carcinomi intraepiteliali sierosi derivano dall’infundibulum nei modelli murini e dalla corrispondente regione fimbriale nella tuba di Falloppio umana. Il protocollo qui descritto descrive un metodo per la microdissezione per suddividere l’ovidotto in modo tale da produrre una quantità e una purezza sufficienti di RNA necessarie per l’analisi a valle come la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) e il sequenziamento dell’RNA (RNAseq). Viene inoltre descritto un metodo di dissociazione tissutale per lo più non enzimatico appropriato per la citometria a flusso o l’analisi RNAseq a singola cellula di cellule oviduttali completamente differenziate. I metodi descritti faciliteranno ulteriori ricerche utilizzando l’ovidotto murino nel campo della riproduzione, della fertilità, del cancro e dell’immunologia.
L’ovidotto murino è simile per funzione e morfologia alla tuba di Falloppio umana1. Entrambi sono costituiti da un epitelio ciliato pseudostratificato, costituito da due cellule residenti epiteliali storicamente descritte: cellule ciliate e cellule secretorie1,2. L’ovidotto ha tre segmenti classicamente riconosciuti: l’infundibulum, l’ampolla e l’istmo. In un recente studio, Harwalkar et al. 3 hanno studiato la morfologia dell’ovidotto e l’espressione genica che ha portato all’espansione della categorizzazione delle cellule epiteliali residenti a sette popolazioni distinte. Inoltre, hanno stabilito la giunzione ampollare-istmo come un segmento distinto dell’ovidotto3. Il metodo qui descritto, che si concentra sull’infundibulum, l’ampolla e l’istmo, potrebbe essere facilmente esteso per includere anche la giunzione ampollare-istmmica2,3. La regione infundibolare contiene l’ostio, o apertura dell’ovidotto, e comprende la regione fimbriale e il gambo prossimale. Spostandosi verso l’utero, il prossimo è l’ampolla, e poi l’istmo. Le cellule ciliate sono più prominenti nell’estremità distale della regione, prossimali all’ovaio o all’infundibulum, mentre le cellule secretorie sono più prominenti nell’estremità prossimale o nel segmento dell’istmo1. A differenza della tuba di Falloppio umana, l’ovidotto murino è una struttura a spirale sostenuta dal mesosalpinx, un’estensione del legamento largo peritoneo1,4. Inoltre, l’ovidotto di topo è racchiuso in un sacco bursale che aumenta la probabilità di trasferimento di ovociti nell’ovidotto4. L’ampolla è identificata come il luogo della fecondazione, da cui gli embrioni in via di sviluppo passano nell’istmo prima di entrare nell’utero5. I segmenti tubarici hanno un diametro di 200-400 μm e le regioni ampollari e istmo più lunghe sono lunghe circa 0,5-1,0 cm4. L’ovidotto si distende durante il ciclo estrale e l’ampolla e l’infundibulum sono più distensibili dell’istmo1.
L’eccessiva proliferazione delle cellule, in particolare le cellule secretorie, caratterizza le lesioni precursori dei tumori sierosi presenti nella cavità pelvica6. Queste lesioni intraepiteliali sierose precursori insorgono nell’epitelio dell’ovidotto esclusivamente nella regione fimbriale; non è noto il motivo per cui la formazione di lesioni è limitata a questa regione dove normalmente il tipo cellulare predominante è ciliato, non secretorio2,7,8. La regionalità in termini di normale funzione fisiologica, nonché l’accresciuto interesse per l’origine oviduttale del carcinoma ovarico9,10,11,12,13, sottolinea l’importanza di una valutazione separata dei segmenti dell’ovidotto.
Il metodo qui descritto descrive in dettaglio la raccolta di segmenti oviduttali separati per le successive analisi a valle dell’espressione genica specifica del segmento e della funzione delle cellule dissociate. Tradizionalmente, molti tessuti vengono elaborati per l’estrazione dell’RNA intero seguendo il metodo del cloroformio fenolo: o un metodo di estrazione completo su colonna; tuttavia, abbiamo scoperto che la qualità dell’RNA è stata mantenuta producendo una resa sufficiente con il metodo di combinazione descritto. Utilizzando questo metodo, segmenti funzionali molto piccoli dell’ovidotto possono essere elaborati per analisi a valle piuttosto che indagare l’ovidotto nel suo complesso, il che può mascherare risultati rappresentativi dei diversi segmenti14.
Le cellule oviduttali murine dissociate sono state raramente studiate mediante citometria a flusso, molto probabilmente a causa della resa cellulare limitante di questo tessuto. Un approccio per superare questo problema è stato quello di dissociare le cellule, farle crescere in coltura e quindi stimolare la ri-differenziazione in vitro per ottenere numeri di cellule appropriati per l’analisi cellulare a valle15,16,17,18. Una limitazione a questo approccio è il tempo ex vivo e il microambiente alterato in coltura, entrambi i quali probabilmente cambiano l’espressione genica. C’è anche l’ipotesi che il ridis differenziato morfologico abbia la stessa firma trascrizionale e proteomica presente nell’animale intatto. L’attuale metodo di dissociazione è stato progettato per ottenere il maggior numero di cellule epiteliali in una popolazione eterogenea di cellule oviduttali, mantenendo la differenziazione a singola cellula. Inoltre, l’approccio per lo più non enzimatico probabilmente limita la perdita di proteine di superficie cellulare.
I tre segmenti dell’ovidotto sono istologicamente, morfologicamente e funzionalmente distinti1,2,3. L’epitelio varia notevolmente da un’estremità all’altra dell’ovidotto. Le cellule ciliate dominano all’estremità fibriale/infundibolare, mentre le cellule secretorie dominano nella regione istmica1. Mentre questo gradiente complessivo è stato riconosciuto per qualche tempo, lavori recenti hanno scoperto …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato in parte da un DoD Breakthrough Award ad AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR è stato parzialmente supportato da borse di studio intramurali: la Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship e la Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences e University of California, Riverside, premi intramurali: il Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant e il Graduate Division Dissertation Year Program Award. Gli autori ringraziano Gillian M. Wright e Alyssa M. Kumari per l’assistenza nella risoluzione precoce di questo metodo.
0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
25G needle | BD | 305122 | |
60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |