Detta protokoll beskriver alloptisk kontroll och observation av utlöst cellulär aktivitet i iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CM) för läkemedelsscreening och toxicitetstestning med hög genomströmning. Multiparametrisk kvantifiering av fenotypiska mönster i tid och rum visas. Långtidseffekter av läkemedel över timmar, eller sekventiella mätningar över dagar, demonstreras.
Att förstå hur exciterbara celler fungerar vid hälsa och sjukdom och hur det beteendet kan förändras av små molekyler eller genmanipulation är viktigt. Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) med flera emissionsfönster kan kombineras (t.ex. för samtidig observation av distinkta subcellulära händelser) eller användas i utökade applikationer med andra ljusberoende ställdon i exciterbara celler (t.ex. kombinera genetiskt kodad optogenetisk kontroll med spektralt kompatibla kalciumindikatorer). Sådana metoder har använts i primära eller stamcellsderiverade neuroner, kardiomyocyter och beta-celler i bukspottkörteln. Det har dock varit utmanande att öka genomströmningen, eller varaktigheten av observationen, av sådana tillvägagångssätt på grund av begränsningar av instrumenten, analysprogramvaran, indikatorprestanda och genleveranseffektivitet. Här kombineras en högpresterande grön GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) och rödförskjuten GECI, K-GECO, med optogenetisk kontroll för att uppnå alloptisk kontroll och visualisering av cellulär aktivitet i ett bildformat med hög genomströmning med hjälp av ett High-Content Imaging System. Applikationer som visar kardiotoxicitetstestning och fenotypisk läkemedelsscreening med friska och patient-härledda iPSC-CM visas. Dessutom demonstreras multiparametriska bedömningar med kombinationer av spektral- och kalciumaffinitetsindikatorvarianter (NIR-GECO, LAR-GECO och mtGCEPIA eller Orai1-G-GECO) begränsade till olika cellulära fack i iPSC-CM-modellen.
Människobaserade inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda modeller anses vara en lovande lösning på 3R-målen (Replacement, Reduction, and Refinement) som anges för djurstudier 1,2. iPSC-härledda kardiomyocyter har använts för sjukdomsmodellering och läkemedelsupptäckt eftersom de rekapitulerar väsentliga aspekter av mänsklig biologi3. Kalciumavbildning, vanligtvis med kemiska färgämnen, har använts för att observera cellulär aktivitet före och efter läkemedelsbehandling 4,5. Kemiska färgämnesbaserade kalciumavkännande sonder hämmar emellertid direkt Na, K-ATPas och stör cellulär funktion6. Således har det varit problematiskt att spåra samma celler över timmar eller dagar när kemiska färgämnen används. Här används en rad genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs)7,8,9,10 över ett brett excitations-/emissions- och kalciumaffinitetsspektrum för att bilda en testplattform för hjärttoxicitet som erbjuder realtidsmätningar av flera organeller under längre tidsperioder11.
För att vidareutveckla det kalciumbaserade screeningkonceptet med hög genomströmning i iPSC-CM-modellen bortom det tidigare demonstrerade akademiska sammanhanget med hjälp av genetiskt kodade verktyg för optisk kontroll och kalciumavbildning genom samuttryck av en rödförskjuten kalciumindikator, R-GECO eller K-GECO med ett optogenetiskt verktyg, ChR212,13, har off-the-shelf virala kit genererats. Genom att övergå till ett höginnehållsinstrument utrustat med ett automikrofluidiskt system skiktas enkanals pipettering av sammansatt tillsats ovanpå levande cellavbildning. Slutligen förbättras och automatiseras båda viktiga aspekter av experimentvägen, bildbehandling och analys.
För att framgångsrikt kunna utföra screening med hög genomströmning måste signalerna fördelas jämnt över odlingskärlet, vilket garanterar att slumpmässigt utvalda regioner av intresse (ROI) kan tillämpas automatiskt under bildförvärv. Även om kemiska kalciumindikatorer lätt uppfyller detta krav, har genetiskt kodade sonder historiskt producerat fläckar, snarare än ark, av signal som begränsar deras användning. Användningen av ett viralt transduktionssystem ger höga27,28 och ekvivalenta uttrycksnivåer för flera indikatorer bland målcellerna jämfört med konventionella transfektionsmetoder. Olika celltyper kan kräva olika promotorer, och valet av genleveranssystem kan behöva ändras i enlighet därmed 29,30,31. I heterogena cellmodeller kan transduktion och uttryckseffektivitet vara olika i specifika celltyper. Å ena sidan kan detta begränsa tillämpningen till vissa celler, men fenomenet kan utnyttjas för att skilja vissa celler i ett samodlingssystem32.
Huvudeffekten av detta tillvägagångssätt är befrielsen från en-till-en-förhållandet mellan experimentet och provet genom automatisering. I ett vanligt multibrunnsexperiment, för att samla in data vid fyra positioner inom en enda brunn, uppskattar vi att det tar cirka 15 timmar vid mikroskopet att samla 30 s-videor från en 96-brunnsplatta. I det automatiserade systemet tar detta ~ 4 h. Dessutom tar analys av data manuellt mycket längre tid än datainsamling. Analyssystemet som används här är cirka 200 gånger snabbare än den manuella motsvarigheten. Nettoresultatet är ett förbättrat arbetsflöde och höga kostnads- och tidsbesparingar.
Till skillnad från primära kardiomyocyter laddade med kalciumfärger som överlever i storleksordningen timmar, kan GECIs uttryckta i iPSC-CM: s via virala leveranssystem ge en signal i en experimentell modell som lever i några månader. Dessa modeller kan underhållas i ett multibrunnsformat och spåras samtidigt för seriell analys i höginnehållsavbildningssystem utvecklade för screening av små molekyler. Detta ger en enkel mänsklig experimentell plattform för att testa läkemedelseffekter under varaktigheter närmare de som upplevs av patienter (veckor eller månader) snarare än de minuter som vanligtvis används i toxikologiska analyser.
Systemet kan utökas för att leverera mätningar med flera parametrar genom att inkludera GECIs med distinkta utsläppsegenskaper från grönt till nära infrarött. Sådana experiment kräver korrekt excitationsljus och filteruppsättningar i den experimentella designen för att hålla signalerna åtskilda. Bred tillämpning i ett läkemedelsscreeningssammanhang kräver robusta och effektiva analysplattformar utöver läkemedelsdispensering. Även om modellen som beskrivs här fokuserar på användningen av flera dynamiska kalciumindikatorer, kan detta modifieras till strukturella markörer för cellform eller funktion. Dessa är vanligtvis lättare att visualisera eftersom de visar liten beat-to-beat-variabilitet jämfört med den hundrafaldiga variationen i intracellulär kalciumkoncentration. Detta tillvägagångssätt kan vara särskilt värdefullt för sällsynta sjukdomar där iPSC-intermediären som härrör från patienter kan innehålla alla genetiska drivkrafter och modifierare av ett visst tillstånd som kan bevaras i en skalbar cellmodell, vilket underlättar läkemedelsupptäckt i olika sjukdomar baserade på cellulära fenotyper som kan visualiseras oberoende av den underliggande biologiska mekanismen som kan vara utmanande att belysa.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar professor Robert Campbell vid University of Tokyo för att ha delat materialet och den värdefulla diskussionen; Dr. Chia-Lin Ho i Molecular Device för teknisk support.
96-well plate | Perkin Elmer | 6055302 | |
auto microfluidic system | Molecular Device | A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 1096780100 | |
Dofetilide | Sigma-Aldrich | PZ0016 | |
E4031 | Tocris | 1808 | |
ER-LAR-GECO viral kit | LumiSTAR | AA001a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Chmical calcium sensitive dye |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System | Molecular Device | ||
iPSC-CMs Maintenance Medium | NEXEL | CMS-002 | iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement |
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) | NEXEL | CMS-002 | |
K-GECO viral kit | LumiSTAR | AA005a | Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector |
LumiCAL software | LumiSTAR | LUCS01a | Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes |
mNG-GECO viral kit | LumiSTAR | AL008a | Brighter green GECI packed into lenti-viral vector |
mt-GCEPIA3 viral kit | LumiSTAR | AL011a | GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector |
NIR-GECO viral kit | LumiSTAR | AV004a | Near infrared GECI packed into viral vector |
Orai1-GGECO viral kit | LumiSTAR | AL010a | GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector |
Tyrode's salts | Sigma-Aldrich | T2145 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 |