Usare l'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti
Summary
I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.
Abstract
Questo protocollo dimostra i passaggi necessari per utilizzare strumenti optogenetici per invertire la plasticità indotta dalla cocaina nei circuiti talamo-amigdala per ridurre i successivi comportamenti di ricerca della cocaina nel ratto. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che quando i ratti si auto-somministrano cocaina per via endovenosa accoppiata con un segnale audiovisivo, le sinapsi si formano agli input dal nucleo genicolato mediale del talamo (MGN) sui principali neuroni dell’amigdala laterale (LA) diventano più forti man mano che viene appresa l’associazione cue-cocaina. Abbiamo ipotizzato che l’inversione della plasticità indotta dalla cocaina in queste sinapsi ridurrebbe il comportamento di ricerca della cocaina motivato dal segnale. Per realizzare questo tipo di neuromodulazione in vivo, abbiamo voluto indurre la depressione sinaptica a lungo termine (LTD), che diminuisce la forza delle sinapsi MGN-LA. A tal fine, abbiamo usato l’optogenetica, che consente la neuromodulazione dei circuiti cerebrali usando la luce. L’opsina eccitatoria oChiEF è stata espressa sui terminali presinaptici MGN nel LA infondendo un AAV contenente oChiEF nel MGN. Le fibre ottiche sono state quindi impiantate nel LA e la luce laser a 473 nm è stata pulsata ad una frequenza di 1 Hz per 15 minuti per indurre LTD e invertire la plasticità indotta dalla cocaina. Questa manipolazione produce una riduzione duratura della capacità dei segnali associati alla cocaina di indurre azioni di ricerca di droga.
Introduction
L’abuso di sostanze è un problema di salute pubblica molto serio negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Nonostante decenni di intensa ricerca, ci sono pochissime opzioni terapeutiche efficaci 1,2. Una grave battuta d’arresto per il trattamento è il fatto che l’uso cronico di droghe genera memorie associative a lungo termine tra i segnali ambientali e il farmaco stesso. La riesposizione a segnali correlati alla droga guida risposte fisiologiche e comportamentali che motivano il consumo continuato di droghe e la ricaduta3. Una nuova strategia terapeutica è quella di mettere in atto trattamenti basati sulla memoria che mirano a manipolare i circuiti coinvolti nella regolazione delle associazioni farmaco-segnale. Recentemente, è stato osservato che le sinapsi nell’amigdala laterale (LA), in particolare quelle derivanti dal nucleo genicolato mediale (MGN) del talamo, sono rafforzate da ripetute auto-somministrazioni di cocaina associate a cue, e che questo potenziamento può supportare il comportamento di ricerca della cocaina 4,5. Pertanto, è stato proposto che il reintegro indotto dal cue potrebbe essere attenuato invertendo la plasticità nelle sinapsi MGN-LA.
La capacità di indirizzare con precisione la plasticità sinaptica di uno specifico circuito cerebrale è stata una grande sfida per il campo. Gli strumenti farmacologici tradizionali hanno avuto un certo successo nel ridurre i comportamenti di ricaduta, ma sono limitati dall’incapacità di manipolare le singole sinapsi. Tuttavia, il recente sviluppo dell’optogenetica in vivo ha fornito gli strumenti necessari per superare queste limitazioni e controllare i percorsi neurali con precisione temporale e spaziale 6,7,8. Esprimendo opsine sensibili alla luce in uno specifico circuito cerebrale, la luce laser può quindi essere utilizzata per attivare o inibire il circuito. La stimolazione ottica dipendente dalla frequenza può essere utilizzata per manipolare specificamente la plasticità sinaptica del circuito in un animale che si comporta.
Questo manoscritto delinea la procedura adottata per manipolare il circuito MGN-LA rilevante dal punto di vista comportamentale utilizzando l’optogenetica in vivo . In primo luogo, l’opsina eccitatoria oChIEF è stata espressa nel MGN e le fibre ottiche sono state impiantate bilateralmente nel LA. Gli animali sono stati quindi addestrati ad auto-somministrarsi cocaina in modo dipendente dal segnale, che potenzia il percorso MGN-LA. Successivamente, la stimolazione sostenuta a bassa frequenza con luce laser a 473 nm è stata utilizzata per produrre LTD specifico del circuito. L’inversione della plasticità indotta dall’uso di cocaina ha generato una riduzione duratura della capacità dei segnali di innescare azioni associate al comportamento di ricerca di droghe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come descritto sopra, ci sono diversi passaggi critici che sono importanti per ottenere i risultati sperimentali corretti. Il protocollo sarà probabilmente efficace solo negli animali che acquisiscono correttamente l’autosomministrazione di cocaina e, ad oggi, è stato testato solo utilizzando i parametri sopra descritti. È possibile che la dose di cocaina, il programma di rinforzo e i parametri di cue possano essere modificati con probabilmente scarso effetto sui risultati comportamentali, con l’eccezione che un progr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il supporto delle sovvenzioni USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) e del Dipartimento della Salute della Pennsylvania.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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