흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼

Summary

이 기사는 흑색종 전이의 새로운 후보 매개체와 그 작용 메커니즘을 테스트하는 데 사용되는 기술의 워크 플로우에 대해 설명합니다.

Abstract

전이는 복잡한 과정으로, 세포가 시험관내 분석에 의해서만 불완전하게 모델링되는 장벽을 극복해야 합니다. 강력하고 재현 가능한 생체 내 모델과 흑색종 전이에서 새로운 선수를 식별하기위한 표준화 된 방법을 사용하여 체계적인 워크 플로우가 수립되었습니다. 이 접근법은 특정 실험 단계에서 데이터 추론을 허용하여 전이에서 유전자의 역할을 정확하게 특성화합니다. 모델은 마우스에 심장내, 피내 또는 피하 주사를 통해 유전자 변형 흑색종 세포를 도입한 다음, 일련의 생체내 영상으로 모니터링함으로써 확립된다. 일단 미리 확립된 종점에 도달하면, 원발성 종양 및/또는 전이-보유 장기가 다양한 분석을 위해 수확되고 처리된다. 종양 세포를 분류하고 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함한 여러 'omics'플랫폼 중 하나를 실시할 수 있습니다. 장기는 전이의 전반적인 부담을 정량화하고 특정 해부학 적 위치를지도화하기 위해 이미징 및 면역 조직 병리학 적 분석을 거칩니다. 생착, 모니터링, 조직 수확, 처리 및 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 포함하는 이 최적화된 파이프라인은 환자 유도, 단기 배양 및 다양한 고형암 유형의 확립된 인간 및 뮤린 세포주에 채택될 수 있다.

Introduction

전이성 흑색종과 관련된 높은 사망률과 전 세계적으로 흑색종의 발생률 증가^{와 결합 1} (2025 년까지 약 7.86 % 증가)은 새로운 치료 접근법을 요구합니다. 표적 발견의 발전은 매우 복잡한 과정인 재현 가능한 전이 모델에 달려 있습니다. 전이성 캐스케이드의 단계를 통틀어, 흑색종 세포는 면역계 회피 및 먼 조직의 식민지화를 달성하기 위해 무수한 장벽을 극복해야 한다². 흑색종 세포의 탄력성과 적응성은 높은 유전 적 돌연변이 부담 3과 신경 볏 기원을 포함한 다양한 요인에서 발생하며, 이는 중요한 표현형 가소성 ^3,4,5를 부여합니다. 각 단계에서, 전사 프로그램은 전이된 흑색종 세포가 면역계(⁶), 세포외 환경(^7,8), 및 이들이 접촉하는 물리적 장벽⁽⁹)의 세포 구조를 포함하는 미세환경과의 누화로부터의 단....

Protocol

참고 : 다음 프로토콜과 관련된 동물 절차는 뉴욕 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)가 승인 한 시설에서 수행됩니다. 도 1은 일반적인 실험 접근법을 도시한다.

1. 환자 유래 흑색종 단기 배양(STCs)

1. 조직을 1mL의 완전 RPMI(10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 1mM 피루베이트 나트륨, 1x MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린(100 IU/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)으로 보충된 RPMI 1640)이 있는 60mm 페트리 접시에 넣습니다.
   참고 : 종양 세포의 비율을 높이려면 필요한 경우 멸균 수술 도구를 사용하여 현미경으로 페트리 접시에서 종양을 둘러싼 조직을 해부하고 제거하십시오.
2. 멸균 된 면도날을 사용하여 신선한 조직을 1-2mm 큐브로 잘게 자릅니다. 완전한 RPMI 4 mL를 첨가하고 10 mL 혈청 학적 피펫으로 플레이트의 내용물을 5-10 회 위아래로 피펫하십시오.
3. 세포 현탁액을 15 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 아래로 스핀....

Results

다음 그림은 흑색종 전이의 새로운 동인을 식별하기 위해 설명 된 워크 플로가 어떻게 적용되었는지 보여줍니다. 도 2 는 생체내 흑색종 전이에서 푸코실트랜스퍼라제 FUT8을 침묵시키는 효과가 연구되었던 공개된 연구의 결과를 요약한 것이다(²⁶). 간략하게, 인간 환자 글리코믹 데이터(렉틴 어레이에 의해 얻어짐) 및 전사 프로파일링의 분석은 1차 흑색종에서 전이성 흑색종으로의 진행과 관련된 알파-1,6-푸코스의 증가된 수준을 밝혀냈으며, 상응하는 푸코실트랜스퍼라제(FUT8)의 증가와 일치한다.

FUT8 shRNA 또는 상응하는 비표적화 대조군(shNTC)을 운반하는 렌티바이러스로 형질도입된 113/6-4L 흑색종 세포를 상기 기술된 바와 같이 면역결핍 마우스(NSG)에 초음파 유도 심장 내 주사에 의해 도입하였다(섹션 2.9). 마우스를 생체내 BLI에 의.......

Discussion

이 기술 보고서의 목적은 흑색종 전이의 잠재적 인 행위자에 대한 조사를위한 표준화 된 상하 워크 플로우를 제공하는 것입니다. 생체 내 실험은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 효율성을 극대화하고 획득한 정보의 가치를 높이기 위한 전략이 가장 중요합니다.

동일한 실험 내에서 결과를 교차 검증하기 위해 보완적인 접근법을 사용하는 것이 필수적입니다. 예를 들어, NuMA 면역조직화학 염색과 BLI 둘 다 포괄적이지 않기 때문에 전이성 부담을 정량화하는 상보적인 방법이다. BLI는 생체 내에서 종양 진행을 추적하는 매우 중요하고 비침습적인 방법이지만, 이러한 데이터는 본질적으로 낮은 분해능을 가지고 있습니다. NuMA 염색은 고정 된 장기에서 전이성 부담의 세심한 분석을 가능하게합니다. 그러나 전체 조직 두께를 통한 포괄적 인 절편은 비실용적입니다. 따라서 각 기관의 샘플 만 염색 할 수 있습니다. 실제로, 저자의 경험에서, BLI 결과가.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 스케이프 블레이드	WPI	500242	수술 절차
#3 Scapel 핸들	WPI	500236	수술 절차용
1 mL 투베르큘린 주사기, 슬립 팁	BD	309626	주입
10 mL 주사기, 슬립 팁	BD	301029	관류
10% 포르말린 나트륨 버퍼	EK 산업	4499-20L	관류/조직 고정제
15 mL 원뿔	코닝용	430052	세포 배양
15 mL 원뿔형 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브	Falcon	352196	세포 배양
200 증거 에탄올	Deacon Labs	04-355-223	조직학
22G – 22mm 바늘	BD	305156	관류
4-0 Vicryl 봉합	Ethicon	J464G	봉합사
4 % Carson의 인산염 완충 파라포름알데히드	EMS	15733-10	관류/조직 고정제
40µ를 위해; m	Corning	431750	조직 처리
5-0 흡수성 봉합사	Ethicon	6542000	클로저
50 mL 원추형	코닝	430828	세포 배양
50mL 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Falcon	352070	세포 배양
7-0 실크 봉합사	FST	18020-70	합자
70&마이크로; m	Corning	431751	조직 처리
페이드 방지 마운팅 미디어	Vector Labs	H-1000-10	면역형광
추정기 적용 펜치, 10cm	WPI	14189	미세수술 절차용
Avance	Bruker	3 HD	NMR 콘솔
바이오스펙 7030	Bruker	7030	마이크로 MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA 염색
Castroviejo 봉합 펑크, 직선 팁 5.5mm 타이링 플랫폼, 11cm	WPI	WP5025501	미세수술 절차를 위한
Coplin Staining Jar	Bel-Art	F44208-1000	조직학
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	면역 형광
dCas9-KRAB	Addgene	110820	유전자 조작
DNase I	NEB	M0303L	조직 처리
DPBS	Corning	21-030-CM	조직 처리
매우 날카로운 코팅되지 않은 단일 가장자리 블레이드	GEM	62-0167	조직 처리
세포외 매트릭스 기질	코닝	354234	성장 요인 감소를 고려합니다(대안으로
FBS	Cytiva	SH30910.03	세포 배양
피지 이미지 J	피지 이미지 J	소프트웨어	면역형광
염소 항토끼 HRP 결합 멀티머	Thermo Fisher	A16104	NuMA 염색
염소 세럼	Gibco	PCN5000	면역형광
HBSS	Corning	21-020-CV	조직 처리
Hematoxylin	리처드-앨런 사이언티픽	7231	조직학
일루미나 III	PerkinElmer	CLS136334	BLI 기기
인슐린 주사기 28G - 8mm 바늘	BD	329424	주사
인슐린 주사기 31G - 6mm 바늘	BD	326730	주입
홍채 집게, 10.2cm, 전체 곡선, 톱니 모양의	WPI	504478	관류 및 수술 절차
Isoflurane USP	Covetrus	11695067772	Anesthesia
Jewelers # 7 집게 티타늄 11cm 0.07 x 0.01 mm 팁		WPI WP6570	미세 수술 절차
Ketamine HCl 100mg / mL	Mylan Ind.	1049007	마취
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	유전자 조작
Lycopersicon Esculentum (토마토) Lectin, DyLight 649	Invitrogen	L32472	혈관 내피 세포 마커
MEM 비 필수 아미노산 X 100	Corning	25-025-CI	세포 배양
Metzenbaum 가위	WPI	503269	외과 용 절차
Microinjection Unit	KOPF	5000	심장 내 주사
NaCl	Fisher	S25877	NuMA 염색
바늘 30G x 25mm	BD	305128	심장 주사
바늘 33G x 15mm	Hamilton	7747-01	경동맥 주사
바늘 홀더, Castroviejo, 14cm, 잠금 장치 포함, 1.2mm 톱니 턱	WPI	14137-G	미세 수술 절차
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스	The Jackson Laboratory	005557	Murine model
NU/J 마우스	The Jackson Laboratory	002019	Murine 모델
핵 유사분열 장치 단백질 다클론 토끼 반인간	Abcam	97585	NuMA 염색
페니실린-스트렙토마이신 10000U/mL	Gibco	15140122	세포 배양
Percoll	GE	0891-01	밀도 분리 용액
PI Classic Surgical Gloves	Cardinal Health	2D72PT75X	Surgery
pLKO Tet-On	Addgene	21915	유전자 조작
포비돈-요오드 10% 용액	Medline	MDS093943	Surgery
Proparacaine 방울 0.5%	Akorn Pharma	AX0501	안과 국소 마취제
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment	Dechra	83592	마취
면도날 더블 엣지 블레이드	EMS	72000	면도 및 진동 브레인 슬라이싱
Reflex 9mm EZ 클립	브레인트리	EZC-  KIT	상처 클로저
RPMI 1640	Corning	10-040-CM	세포 배양
가위, 스프링 10.5cm Str, 8mm 블레이드	WPI	501235	미세 수술 절차용
반자동 진동 블레이드 마이크로톰	Leica	VT1200	Brain Slice 면역형광
단일 채널 마취 기화기 시스템	Kent Scientific	VetFlo-1210S	마취
Smartbox 탁상용 챔버 시스템 및 배기 블로워	EZ 시스템	TT4000	CO2 안락사
멸균 창포 일회용 드레이프		Medline NON21002	수술
스테임 비강화 오로라 수술 가운 세트인 슬리브	Medline	DYNJP2715	수술
T25 플라스크	코닝	430639	세포 배양
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA 염색
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	면역 형광
Troutman 묶는 집게, 10cm, 곡선 G 패턴, 묶는 플랫폼이있는 0.52mm 팁	WPI	WP505210	미세 수술 절차 용
용기 클립 10G 압력 5x 0.8mm 턱, 5 / pkg	WPI	15911	용 미세 수술 절차
Visiopharm	Visiopharm	Visiopharm	NuMA 염색 정량 소프트웨어
Xylasine 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	마취
Xylene	Fisher	X3P-1GAL	조직학