JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Синтез масаримицина, ингибитора малых молекул грамположительного бактериального роста

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

Представлен подробный протокол получения бактериостатического диамида масаримицина, маломолекулярного зонда, который ингибирует рост Bacillus subtilis и Streptococcus pneumoniae путем нацеливания на деградацию клеточной стенки. Его применение в качестве химического зонда продемонстрировано в анализах синергизма/антагонизма и морфологических исследованиях с B. subtilis и S. pneumoniae.

Abstract

Пептидогликан (ПГ) в клеточной стенке бактерий представляет собой уникальную макромолекулярную структуру, которая придает форму и защиту от окружающей среды. Центральное место в понимании роста и деления клеток занимает знание того, как деградация ПГ влияет на биосинтез и сборку клеточной стенки. Недавно сообщалось о метаболической маркировке ПГ путем введения модифицированных сахаров или аминокислот. В то время как химический опрос биосинтетических ступеней с ингибиторами малых молекул возможен, инструменты химической биологии для изучения деградации ПГ автолизинами недостаточно развиты. Бактериальные аутолизины представляют собой широкий класс ферментов, которые участвуют в жестко скоординированной деградации ПГ. Здесь представлен подробный протокол приготовления маломолекулярного зонда масаримицина, который является ингибитором N-ацетилглюкозаминидазы LytG в Bacillus subtilis, и метаболизма клеточной стенки у Streptococcus pneumoniae. Обеспечивается получение ингибитора путем микроволнового и классического органического синтеза. Представлена его применимость как инструмента изучения грамположительной физиологии в биологических анализах.

Introduction

Пептидогликан (PG) представляет собой сетчатый полимер, который очерчивает форму и структуру клеток как у грамположительных, так и у грамотрицательныхбактерий 1,2. Этот гетерополимер представляет собой матрицу аминосахаров, сшитыхкороткими пептидами 3,4,5,6 с основой, состоящей из β-(1,4)-связанных чередующихся N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и N-ацетилмураминовой кислоты (MurNAc) остатков (Рисунок 1)1. К лактиловому фрагменту C-3 MurNAc прикреплен стволовый пептид. Метаболизм ПГ включает в себя тесно скоординированную систему биосинтетических и деградирующих ферментов для включения нового материала в клеточную стенку 7,8. Деградация ПГ осуществляется ферментами, которые в совокупности называются аутолизинами9 и далее классифицируются на основе специфичности расщепленной связи. Аутолизины участвуют во многих клеточных процессах, включая рост клеток, деление клеток, подвижность, созревание ПГ, хемотаксис, секрецию белка, генетическую компетентность, дифференцировку и патогенность10,11. Разгадка специфических биологических функций отдельных аутолизинов может быть сложной задачей, отчасти из-за функциональной избыточности. Тем не менее, недавние биофизические 8,12,13 и вычислительные исследования12 дали новое представление об их роли в метаболизме PG. Кроме того, недавние отчеты дали дальнейшее представление о синтезе14 и мембранно-опосредованных 15,16,17 шагах метаболизма PG. Глубокое понимание взаимосвязи между деградирующими и синтетическими путями метаболизма ПГ может привести к появлению ранее неиспользованных мишеней антибиотиков.

Хотя были достигнуты значительные успехи в методологии изучения гликобиологии у эукариот, бактериальная гликобиология и, в частности, метаболизм ПГ не развивались с одинаковой скоростью. Современные химические подходы к изучению метаболизма ПГ включают флуоресцентно меченые антибиотики18, флуоресцентные зонды19,20 и метаболическую маркировку 21,22,23,24. Эти новые подходы предоставляют новые способы опроса метаболизма бактериальной клеточной стенки. Хотя некоторые из этих стратегий способны маркировать PG in vivo, они могут быть видоспецифичными19 или работать только в штаммах, не имеющих определенного автолизина25. Многие стратегии маркировки ПГ предназначены для использования с изолированными клеточными стенками26 или с восстановленными in vitro путями биосинтезаПГ 20,27,28. Использование флуоресцентно меченных антибиотиков в настоящее время ограничено биосинтетическими этапами и транспептидацией18.

Современные знания о бактериальных аутолизинах и их роли в метаболизме клеточных стенок получены из генетического и биохимического анализа in vitro 11,29,30,31,32. Хотя эти подходы предоставили богатую информацию об этом важном классе ферментов, расшифровка их биологической роли может быть сложной задачей. Например, из-за функциональной избыточности33 удаление аутолизина в большинстве случаев не приводит к остановке роста бактерий. И это несмотря на их подразумеваемую роль в росте и делении клеток 7,12. Другое осложнение заключается в том, что генетическая делеция бактериальных аутолизинов может привести к метафенотипам34. Метафенотипы возникают в результате сложного взаимодействия между путем, на который влияет генетическая делеция, и другими взаимосвязанными путями. Например, метафенотип может возникнуть через прямой эффект, такой как отсутствие фермента, или косвенный эффект, такой как нарушение работы регуляторов.

В настоящее время существует всего несколько ингибиторов аутолизинов гликозидазы, таких как N-ацетилглюкозаминидазы (GlcNAcase) и N-ацетилмурамидазы, которые могут быть использованы в качестве химических зондов для изучения деградации ПГ. Чтобы решить эту проблему, диамид масаримицин (ранее называемый fgkc) был идентифицирован и охарактеризован35 как бактериостатический ингибитор роста Bacillus subtilis, который нацелен на GlcNAcase LytG32 (рисунок 1). LytG представляет собой GlcNAcase36 экзоактивного действия, член кластера 2 в семействе гликозилгидролаз 73 (GH73). Это основной активный GlcNAcase во время вегетативного роста32. Насколько нам известно, масаримицин является первым ингибитором PG-действующего GlcNAcase, который ингибирует клеточный рост. Дополнительные исследования масаримицина со Streptococcus pneumoniae показали, что масаримицин, вероятно, ингибирует метаболизм клеточной стенки в этом организме37. Здесь сообщается о препарате масаримицина для использования в качестве химико-биологического зонда для изучения физиологии у грамположительных организмов B. subtilis и S. pneumoniae. Приведены примеры морфологического анализа лечения субминутной ингибирующей концентрацией масаримицином, а также анализ синергизма/антагонизма. Анализ синергии и антагонизма с использованием антибиотиков с четко определенными способами действия может быть полезным способом изучения связей между клеточными процессами 38,39,40.

Protocol

1. Общие методы ПРИМЕЧАНИЕ: Все соединения были закуплены у стандартных поставщиков и использовались без дальнейшей очистки. Проводят тонкослойную хроматографию (TLC) на алюминиевой пластине, предварительно покрытой силикагелем XG F254. Обнаружение пятен под ?…

Representative Results

Масаримицин является низкомолекулярным бактериостатическим ингибитором B. subtilis и S. pneumoniae и, как было показано, ингибирует экзо-действующий GlcNAcase LytG в B. subtilis35,37 и нацелен на клеточную стенку в S. pneumoniae37. Масаримицин может быт…

Discussion

Масаримицин является единственным микромолярным бактериостатическим ингибитором роста B. subtilis35 и S. pneumoniae37 . Было показано, что у B. subtilis масаримицин ингибирует GlcNAcase LytG35, в то время как точная молекулярная мишень в клеточной стенке S. pneumo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования были поддержаны Национальным научным фондом в рамках гранта No 2009522. ЯМР-анализ масаримицина был поддержан грантом Национального научного фонда в рамках гранта No 1919644. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -. V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. 생화학. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -. H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

MasarimycinGram-positive BacteriaAutolysin InhibitorBacterial Growth InhibitorOrganic SynthesisCyclohexylamineCyclohexyl CarboxaldehydeOrtho-iodobenzoic AcidCyclohexyl IsocyanideMethanolThin-layer ChromatographyEthyl AcetateHydrochloric AcidSodium BicarbonateSodium ChlorideSodium Sulfate
check_url/kr/63191?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image