Method Article

그람 양성 박테리아 성장의 소분자 억제제 인 Masarimycin의 합성

DOI:

10.3791/63191

⸱

January 7th, 2022

 ,  , 
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포벽 분해를 표적화함으로써 바실러스 서브틸 리스 및 스트렙토코커스 폐렴 의 성장을 억제하는 소분자 프로브인 정균성 디아미드 마사리마이신을 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 화학 프로브로서의 그것의 적용은 B. subtilis 및 S. pneumoniae를 사용한 시너지 효과 / 길항작용 분석 및 형태 학적 연구에서 입증됩니다.

Abstract

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박테리아의 세포벽에있는 펩티도글리칸 (PG)은 모양과 주변 환경으로부터의 보호를 부여하는 독특한 거대 분자 구조입니다. 세포 성장과 분열을 이해하는 핵심은 PG 분해가 생합성 및 세포벽 조립에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 지식입니다. 최근에, 변형된 당 또는 아미노산의 도입을 통한 PG의 대사 표지가 보고되고 있다. 소분자 억제제를 사용한 생합성 단계의 화학적 심문이 가능하지만, autolysins에 의한 PG 분해를 연구하기위한 화학 생물학 도구는 저개발되어 있습니다. 박테리아 autolysins는 PG의 긴밀하게 배위된 분해에 관여하는 효소의 광범위한 부류이다. 여기에서, 바실러스 서브틸리스 에서 N-아세틸글루코사미니다제 LytG의 억제제인 소분자 프로브인 마사리마이신, 및 폐렴구균에서 세포벽 대사를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 마이크로파 보조 및 고전적 유기 합성을 통한 억제제의 제조가 제공된다. 생물학적 분석에서 그람 양성 생리학을 연구하는 도구로서의 적용 가능성이 제시됩니다.

Introduction

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펩티도글리칸(PG)은 그람 양성균과 그람 음성 박테리아 1,2 모두에서 세포 모양과 구조를 묘사하는 메쉬형 폴리머이다. 이러한 헤테로폴리머는 짧은 펩티드3,4,5,6에 의해 가교결합된 아미노 당류의 매트릭스이며, β-(1,4)-연결된 교대 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸무람산(MurNAc) 잔기로 구성된 백본을 갖는다(도 1)1. MurNAc의 C-3 락틸 모이어티에 부착된 것은 줄기 펩티드이다. PG의 신진 대사는 세포벽 7,8에 새로운 물질을 통합하기 위해 생합성 및 분해 효소의 밀접하게 조정 된 시스템을 포함한다. PG의 분해는 자율분해신9로 총칭되는 효소에 의해 수행되고, 절단된 결합의 특이성에 ....

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Protocol

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1. 일반적인 방법

참고: 모든 화합물은 표준 공급업체로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다.

  1. 실리카 겔 XG F254로 예비코팅된 알루미늄 플레이트에 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하십시오. UV 램프 아래, p-anisaldehyde 얼룩에 침지하거나 I2 증기에 노출시켜 반점을 감지합니다.
  2. 모든 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 400MHz 분광계에 기록합니다.
    참고: 1H-NMR 및 13C-NMR스펙트럼은 잔류 용매 피크를 참조하였다. 커플링 상수는 [Hz]로 주어지고 화학적 이동은 [ppm]으로 주어집니다.
  3. 대기압 화학 이온화 (APCI) 마사리 마이신의 질량 분광법 스펙트럼을 대기 고체 분석 프로브가 장착 된 소형 질량 분광계에 기록하십시오.

2. 마사리마이신의 제조를 위한 일반적인 절차

참고: 흄 후드에서 아래 단계를 수행하십시오.

  1. 각 반응물의 메탄올 중 0.1 M 용액을 제조하였다: 시클로헥실아민, ....

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Results

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마사리마이신은 B. subtilis 및 S. pneumoniae의 소분자 정균 억제제이며, B. subtilis35,37에서 엑소액 작용 GlcNAcase LytG를 억제하고 S. pneumoniae 37에서 세포벽을 표적으로 하는 것으로 나타났다. Masarimycin은 55 % -70 % 범위의 수율로 고전적 또는 전자 레인지 보조 유기 합성에 의해 효율적으로 제조 될 수 있습니다. 마이크로파 보조 합성은 화합물을 합성하는 데 걸리는 시간이 크게 단축되는 장점이 있다. 마이크로파 보조 합성은 비교 가능한 수율을 유지하면서 합성을 5-6 h (전통적인 합성)에서 2-3 h로 단축시킵니다. 플래시 크로마토그래피는 고순도의 마사리마이신의 신속한 정제를 제공한다(보충 그림 1-2).

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Discussion

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마사리마이신은 B. subtilis35 및 S. pneumoniae37 성장의 단일 마이크로몰 정균 억제제이다. B. subtilis에서, 마사리마이신은 GlcNAcase LytG 35를 억제하는 것으로 나타났지만, S. pneumoniae의 세포벽에서 정확한 분자 표적은 확인되지 않았다37. 고전적인 유기 합성 또는 마이크로파 절차를 사용하여 마사리 마이신의 합성은 억제제를 좋은 수율과 높은 순도로 제공합니다. 마사리마이신의 낮은 수율은 전형적으로 사이클로헥실카르복스알데히드의 산화에 기인할 수 있다. 이를 극복하기 위해, 사이클로헥실 카르복스알데히드를 데시케이터의 불활성 분위기 하에 저장하는 것이 좋습니다. 상응하는 카르복실산에 대한 알데히드의 산화는 병에서 백색 고체로서 볼 수 있다. 사이클로헥실카르복스알데히.......

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Disclosures

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Reid, C. W.는 masarimycin의 특정 응용 프로그램과 관련된 지적 재산권을 보유하고 있습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 번호 2009522에 의해 지원되었습니다. 마사리마이신에 대한 NMR 분석은 국립 과학 재단의 주요 연구 계측 프로그램 어워드에 의해 보조금 번호 1919644에 의해 지원되었다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-요오드벤조산SIGMA-ALDRICHI7675-25G부식성, 자극성, 연황색에서 주황색-갈색 분말
2-프로판올SIGMA-ALDRICH109827-4L가연성, 자극성, 무색 액체
아세토니트릴SIGMA-ALDRICH34851-4L가연성, 자극성, 무색 액체
알루미늄 백업 실리카 플레이트Sorbtech4434126알루미늄 지지판에 실리카겔 XG F254
클로로포름-dSIGMA-ALDRICH151823-50GNMR
소형 질량 분석기Advion-Interchim AdvionCMS소형 질량 분석기 APCI 소스 및 대기 고체 분석 프로브가 장착된
Corning Costar 96 웰 플랫 바닥 플레이트-시너지/길항제 분석을 위한피셔 화학07-200-90
현미경 검사용커버 슬립Fisher Chemical12-547
CyclohexanecarboxaldehydeCHEM-IMPEX INT'L INC.24451가연성, 자극성, 무색 내지 분홍색 액체
시클로헥실 이소시아나이드SIGMA-ALDRICH133302-5G자극성, 무색 액체, 극도로 불쾌한 냄새
시클로헥실아민SIGMA-ALDRICH240648-100ML부식성, 인화성, 자극성, 무색 액체 오염되지 않은
틸 아세테이트SIGMA-ALDRICH537446-4L가연성, 자극성, 무색 액체
플래시 실리카 카트리지 (12g)Advion-InterchimPF-50SIHP-F0012플래시 실리카 컬럼 팩 (12g) masarimycin
포름 알데히드SIGMA-ALDRICHF8775-25ML현미경 용 고착제
HEPESSIGMA-ALDRICHH8651-25G현미경 고정 용액 용 완충제
헥산, 이성질체SIGMA-ALDRICH혼합물178918-4L환경 파괴, 인화성, 자극성, 건강 위험, 무색 액체
고성능 소형 질량 분석기AdvionExpressionAtmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), Low
Resolution High VacEppendorfVacufuge plusvacuum 원심력 및 온도의
도움을 받는 염산SIGMA-ALDRICH258148-2.5L부식성, 자극성, 무색 액체
염산SIGMA-ALDRICH320331-2.5L강산
침지 오일피셔 화학 물질12-365-19현미경 검사
용 요오드, 재승화 결정Alfa Aesar41955환경 파괴, 자극성, 건강 위험, 짙은 회색 / 보라색 결정
Mestre MnovaMestreLab ResearchNMR 스펙트럼 메탄올 처리용 소프트웨어
SIGMA-ALDRICH439193-4L가연성, 독성, 건강 위험, 무색 액체
메틸렌 블루SIGMA-ALDRICHM9140-25G세포벽 염색용 현미경 염색
meuller-hinton 한천 플레이트 + 5% 양 혈액낚시꾼 화학B21176X성장 매체 연쇄상 구균 폐렴
meuller-hinton 국물피셔 케미컬DF0757-17-6폐
현미경 슬라이드현미경피셔 케미컬22-310397
마이크로파 합성 LabstationMILESTONESTART SYNTH장치, 흄 후드 환기가 필요한 장치, 합성 캐러셀
NMR 튜브SIGMA-ALDRICHZ562769-5EA5mm NMR 튜브 600MHz
핵 자기 공명 (NMR)BrukerAscend 400대형 초전도 자석 (400MHz)
optochinfisher 화학AAB21627MC에틸 하이드로 큐프 린 염산염
페트리 플레이트Celltreat229695박테리아 성장을위한 한천 플레이트 준비
Primo Star 명시야 / 위상차 현미경 ERc5s 카메라Zeiss 형태학 연구
puriFlashinterchimXS520plus플래시 크로마토그래피 정제 시스템
resazurinSIGMA-ALDRICHR7017-1G시너지/길항작용 분석을 위한
회전 증발기HeidolphHei-VAP Value "The Collegiate"용매 증발기
중탄산나트륨SIGMA-ALDRICHS6014-500G자극제, 흰색 분말
염화나트륨피셔 화학 물질S271-1결정질, 무색
염화나트륨SIGMA-ALDRICHS5886-500GB.subtilis의 성장 및 LB 매체 준비
황산나트륨SIGMA-ALDRICH7985592-500G무수, 과립, 백색
트립톤피셔 화학 물질BP1421-500B.subtilis의 성장 및 LB 매체 준비
Whitney DG250 워크스테이션Microbiology InternationalDG250혐기성 워크스테이션. 혐기성 가스 혼합물 사용 : 수소 5 %, 이산화탄소 10 %, 균형 질소
효모 추출물피셔 화학BP1422-500B.subtilis 성장 및
현미경 사진 획득을위한Zen Lite (파란색) 소프트웨어Zeiss
용 용매 멸균 에 정제 렴 구균 용 성장 매체 현미경 용 용 LB 매체 준비

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48....

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Masarimycin SynthesisGram Positive InhibitorBacterial AutolysinsPeptidoglycan DegradationFlash ChromatographyThin Layer ChromatographyBacillus SubtilisStreptococcus PneumoniaeCell Wall MetabolismBright Field Microscopy

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