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생화학

Synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

Un protocole détaillé est présenté pour la préparation du diamide bactériostatique masarimycine, une sonde à petites molécules qui inhibe la croissance de Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae en ciblant la dégradation de la paroi cellulaire. Son application en tant que sonde chimique est démontrée dans des essais de synergie/antagonisme et des études morphologiques avec B. subtilis et S. pneumoniae.

Abstract

Le peptidoglycane (PG) dans la paroi cellulaire des bactéries est une structure macromoléculaire unique qui confère une forme et une protection contre l’environnement environnant. Au cœur de la compréhension de la croissance et de la division cellulaires se trouve la connaissance de la façon dont la dégradation du PG influence la biosynthèse et l’assemblage de la paroi cellulaire. Récemment, le marquage métabolique du PG par l’introduction de sucres ou d’acides aminés modifiés a été rapporté. Alors que l’interrogation chimique des étapes biosynthétiques avec de petites molécules inhibitrices est possible, les outils de biologie chimique pour étudier la dégradation du PG par les autolysines sont sous-développés. Les autolysines bactériennes sont une large classe d’enzymes qui sont impliquées dans la dégradation étroitement coordonnée du PG. Ici, un protocole détaillé est présenté pour la préparation d’une sonde à petite molécule, la masarimycine, qui est un inhibiteur de la N-acétylglucosaminidase LytG dans Bacillus subtilis, et le métabolisme de la paroi cellulaire chez Streptococcus pneumoniae. La préparation de l’inhibiteur par micro-ondes et la synthèse organique classique est fournie. Son applicabilité en tant qu’outil d’étude de la physiologie à Gram positif dans les essais biologiques est présentée.

Introduction

Le peptidoglycane (PG) est un polymère en forme de maille qui délimite la forme et la structure des cellules dans les bactéries Gram positif et Gram négatif 1,2. Cet hétéropolymère est une matrice de sucres aminés réticulés par de courts peptides 3,4,5,6 avec un squelette composé de résidus de N-acétylglucosamine (GlcNAc) et d’acide N-acétylmuramique (MurNAc) β(1,4)-liés (Figure 1)1. Attaché à la fraction lactyle C-3 de MurNAc est le peptide de la tige. Le métabolisme du PG implique un système étroitement coordonné d’enzymes biosynthétiques et dégradatives pour incorporer de nouveaux matériaux dans la paroi cellulaire 7,8. La dégradation du PG est effectuée par des enzymes collectivement appelées autolysines9 et classées en fonction de la spécificité de la liaison clivée. Les autolysines participent à de nombreux processus cellulaires, notamment la croissance cellulaire, la division cellulaire, la motilité, la maturation du PG, la chimiotaxie, la sécrétion de protéines, la compétence génétique, la différenciation et la pathogénicité10,11. Démêler les fonctions biologiques spécifiques des autolysines individuelles peut être intimidant, en partie à cause de la redondance fonctionnelle. Cependant, des études biophysiquesrécentes 8,12,13 et des études computationnelles12 ont fourni de nouvelles informations sur leurs rôles dans le métabolisme du PG. En outre, des rapports récents ont fourni des informations supplémentaires sur la synthèse14 et les 15,16,17 étapes médiées par membrane dans le métabolisme du PG. Une compréhension approfondie de la relation entre les voies dégradatives et synthétiques du métabolisme du PG pourrait donner lieu à des cibles antibiotiques inexploitées auparavant.

Bien qu’il y ait eu des progrès significatifs dans la méthodologie pour étudier la glycobiologie chez les eucaryotes, la glycobiologie bactérienne et, en particulier, le métabolisme pg n’a pas progressé à un rythme similaire. Les approches chimiques actuelles pour étudier le métabolisme du PG comprennent les antibiotiques marqués par fluorescence18, les sondes fluorescentes19,20 et le marquage métabolique 21,22,23,24. Ces nouvelles approches offrent de nouvelles façons d’interroger le métabolisme de la paroi cellulaire bactérienne. Bien que certaines de ces stratégies soient capables de marquer le PG in vivo, elles peuvent être spécifiques àl’espèce 19, ou ne fonctionner que dans des souches dépourvues d’une autolysine25 particulière. De nombreuses stratégies de marquage du PG sont destinées à être utilisées avec des parois cellulaires isolées26 ou avec des voies de biosynthèse de PG reconstituées in vitro 20,27,28. L’utilisation d’antibiotiques marqués par fluorescence est actuellement limitée aux étapes biosynthétiques et à la transpeptidation18.

Les connaissances actuelles sur les autolysines bactériennes et leur rôle dans le métabolisme de la paroi cellulaire proviennent de l’analyse génétique et biochimique in vitro 11,29,30,31,32. Bien que ces approches aient fourni une mine d’informations sur cette classe importante d’enzymes, il peut être difficile de déchiffrer leur rôle biologique. Par exemple, en raison de la redondance fonctionnelle33, la suppression d’une autolysine dans la plupart des cas n’entraîne pas l’arrêt de la croissance bactérienne. Ceci malgré leur rôle implicite dans la croissance et la divisioncellulaires 7,12. Une autre complication est que la délétion génétique des autolysines bactériennes peut donner naissance à des méta-phénotypes34. Les métaphénotypes proviennent de l’interaction complexe entre la voie affectée par la délétion génétique et d’autres voies interconnectées. Par exemple, un méta-phénotype peut survenir via un effet direct tel que l’absence d’une enzyme, ou un effet indirect tel qu’une perturbation des régulateurs.

Actuellement, il n’existe que quelques inhibiteurs des autolysines glycosidases telles que les N-acétylglucosaminidases (GlcNAcase) et les N-acétylmuramidases, qui peuvent être utilisées comme sondes chimiques pour étudier la dégradation du PG. Pour y remédier, le diamide masarimycine (précédemment appelé fgkc) a été identifié et caractérisé35 comme un inhibiteur bactériostatique de la croissance de Bacillus subtilis qui cible le GlcNAcase LytG32 (Figure 1). LytG est un GlcNAcase36 à action exo-agissante, membre du groupe 2 de la famille des glycosyl hydrolases 73 (GH73). C’est le principal GlcNAcase actif au cours de la croissance végétative32. À notre connaissance, la masarimycine est le premier inhibiteur d’un GlcNAcase à action PG qui inhibe la croissance cellulaire. Des études supplémentaires sur la masarimycine avec Streptococcus pneumoniae ont révélé que la masarimycine inhibe probablement le métabolisme de la paroi cellulaire dans cet organisme37. Ici, la préparation de masarimycine est rapportée pour une utilisation comme sonde de biologie chimique pour étudier la physiologie dans les organismes à Gram positif B. subtilis et S. pneumoniae. Des exemples d’analyse morphologique d’un traitement à concentration inhibitrice inférieure au minimum avec de la masarimycine, ainsi qu’un test de synergie/antagonisme sont présentés. Les tests de synergie et d’antagonisme utilisant des antibiotiques avec des modes d’action bien définis peuvent être un moyen utile d’explorer les connexions entre les processus cellulaires 38,39,40.

Protocol

1. Méthodes générales REMARQUE: Tous les composés ont été achetés auprès de fournisseurs standard et utilisés sans autre purification. Effectuer une chromatographie sur couche mince (TLC) sur une plaque d’aluminium prélaquée de gel de silice XG F254. Détecter les taches sous une lampe UV, par immersion dans la tache de p-anisaldéhyde, ou en exposant à la vapeurI2 . Enregistrez tous les spectres de résonance magnétique n…

Representative Results

La masarimycine est une petite molécule inhibitrice bactériostatique de B. subtilis et S. pneumoniae et il a été démontré qu’elle inhibe l’exo-action GlcNAcase LytG chez B. subtilis35,37 et cible la paroi cellulaire chez S. pneumoniae37. La masarimycine peut être préparée efficacement par la synthèse organique classique ou assistée par micro-ondes avec des rendements compris entre 55% et 7…

Discussion

La masarimycine est un inhibiteur bactériostatique micromolaire unique de la croissance de B. subtilis35 et de S. pneumoniae37 . Chez B. subtilis, il a été démontré que la masarimycine inhibe le GlcNAcase LytG35, tandis que la cible moléculaire précise dans la paroi cellulaire de S. pneumoniae n’a pas été identifiée37. La synthèse de la masarimycine à l’aide de la synthèse organique …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche a été soutenue par la National Science Foundation sous le numéro de subvention 2009522. L’analyse RMN de la masarimycine a été soutenue par l’attribution d’un important programme d’instrumentation de recherche de la National Science Foundation sous le numéro de subvention 1919644. Toutes les opinions, constatations et conclusions, ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
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References

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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
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