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생화학

Síntese de Masarimicina, um inibidor de pequenas moléculas do crescimento bacteriano gram-positivo

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

Um protocolo detalhado é apresentado para preparar a diamida bacteriostática masarimycina, uma pequena sonda de moléculas que inibe o crescimento de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando a degradação da parede celular. Sua aplicação como sonda química é demonstrada em ensaios de sinergia/antagonismo e estudos morfológicos com B. subtilis e S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglycan (PG) na parede celular das bactérias é uma estrutura macromolecular única que confere forma e proteção do ambiente circundante. Central para entender o crescimento e a divisão celular é o conhecimento de como a degradação do PG influencia a biossíntese e a montagem da parede celular. Recentemente, foi relatada a rotulagem metabólica de PG através da introdução de açúcares modificados ou aminoácidos. Embora o interrogatório químico de passos biossintéticos com inibidores de pequenas moléculas seja possível, ferramentas de biologia química para estudar a degradação de PG por autolysinas são subdesenvolvidas. As autolysinas bacterianas são uma ampla classe de enzimas que estão envolvidas na degradação fortemente coordenada de PG. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o preparo de uma pequena sonda de moléculas, a masarimicina, que é um inibidor de N-acetilglucosaminidase LytG em bacillus subtilis, e metabolismo de parede celular em Streptococcus pneumoniae. A preparação do inibidor por meio de síntese orgânica assistida por micro-ondas e clássica é fornecida. Sua aplicabilidade como ferramenta para estudar fisiologia gram-positiva em ensaios biológicos é apresentada.

Introduction

Peptidoglycan (PG) é um polímero em forma de malha que delineia a forma e a estrutura das células em ambas as bactérias Gram-positivas eGram-negativas 1,2. Este heteropolímero é uma matriz de açúcares aminosatrados intercides por peptídeos curtos 3,4,5,6 com uma espinha dorsal composta de resíduos de β N-acetilglucosamina alternada (GlcNAc) e ácido n-acetilmuramic (MurNAc) (Figura 1)1. Anexado ao c-3 lactyl moiety de MurNAc é o peptídeo de haste. O metabolismo de PG envolve um sistema bem coordenado de enzimas biossintéticas e degradativas para incorporar novo material na paredecelular 7,8. A degradação de PG é realizada por enzimas coletivamente referidas como autolysinas9 e ainda classificadas com base na especificidade do vínculo rachado. As autolysinas participam de muitos processos celulares, incluindo crescimento celular, divisão celular, motilidade, maturação de PG, quimiotáxi, secreção de proteínas, competência genética, diferenciação e patogenicidade10,11. Desvendar as funções biológicas específicas das autolysinas individuais pode ser assustador, devido, em parte, à redundância funcional. No entanto, os recentes estudos biofísicos 8,12,13 e computacionais12 forneceram novas informações sobre seus papéis no metabolismo PG. Além disso, relatórios recentes forneceram mais informações sobre a síntese14 e 15,16,17 passos mediados por membrana no metabolismo pg. Uma compreensão completa da relação entre vias degradativas e sintéticas do metabolismo PG poderia dar origem a alvos antibióticos inexplorados anteriormente.

Embora tenha havido avanços significativos na metodologia para estudar a glicobiologia em eucariotes, a glicobiologia bacteriana e, em particular, o metabolismo PG não avançou a uma taxa semelhante. As abordagens químicas atuais para estudar o metabolismo PG incluem antibióticos fluorescentesrotulados 18, sondas fluorescentes19,20 e rotulagem metabólica 21,22,23,24. Essas novas abordagens estão fornecendo novas maneiras de interrogar o metabolismo da parede celular bacteriana. Embora algumas dessas estratégias sejam capazes de rotular PG in vivo, elas podem ser específicas de espécies19, ou apenas trabalhar em cepas sem uma autolysinaparticular 25. Muitas estratégias de rotulagem PG destinam-se ao uso com paredes celulares isoladas26 ou com vias de biossíntese PG in vitro reconstituídas 20,27,28. Atualmente, o uso de antibióticos fluorescentes é limitado a etapas biossintéticas e transpeptidação18.

O conhecimento atual das autolysinas bacterianas e seu papel no metabolismo da parede celular vem da análise bioquímica genética e in vitro 11,29,30,31,32. Embora essas abordagens tenham fornecido uma riqueza de informações sobre esta importante classe de enzimas, decifrar seu papel biológico pode ser desafiador. Por exemplo, devido à redundância funcional33, a exclusão de uma autolise na maioria dos casos não resulta em interrupção do crescimento bacteriano. Isso apesar de seu papel implícito no crescimento celular e na divisão 7,12. Outra complicação é que a exclusão genética de autolysinas bacterianas pode dar origem a meta-fenótipos34. Os meta-fenótipos surgem da complexa interação entre a via afetada pela exclusão genética e outras vias interconectadas. Por exemplo, um meta-fenótipo pode surgir através de um efeito direto, como a falta de uma enzima, ou um efeito indireto, como uma interrupção dos reguladores.

Atualmente, existem apenas alguns inibidores de glicosidase autolysinas como N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) e N-acetylmuramidases, que podem ser usados como sondas químicas para estudar a degradação de PG. Para lidar com isso, a diamide masarimicina (anteriormente denominada fgkc) foi identificada e caracterizada35 como um inibidor bacteriostático do crescimento de subtilis bacilo que tem como alvo o GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG é um exo-ator glcNAcase36, um membro do cluster 2 dentro da família de hidrolase glicosyl 73 (GH73). É o maior GlcNAcase ativo durante o crescimento vegetativo32. Pelo que sabemos, a masarimicina é o primeiro inibidor de um GLCNAcase de ação pg que inibe o crescimento celular. Estudos adicionais de masarimicina com Streptococcus pneumoniae descobriram que a masarimicina provavelmente inibe o metabolismo da parede celular neste organismo37. Aqui, a preparação da masarimicina é relatada para uso como uma sonda de biologia química para estudar fisiologia nos organismos Gram-positivos B. subtilis, e S. pneumoniae. Exemplos de análise morfológica do tratamento de concentração inibitória submínica com masarimicina, bem como um ensaio de sinergia/antagonismo são apresentados. Ensaios de sinergia e antagonismo usando antibióticos com modos de ação bem definidos podem ser uma maneira útil de explorar conexões entre processos celulares 38,39,40.

Protocol

1. Métodos gerais NOTA: Todos os compostos foram comprados de fornecedores padrão e utilizados sem maiores purificações. Realize cromatografia de camada fina (TLC) em uma placa de alumínio pré-revestida com gel de sílica XG F254. Detecte manchas sob uma lâmpada UV, por imersão na mancha de p-anisaldeído, ou expondo-se ao vapor I2 . Registo de ressonância magnética nuclear (NMR) em um espectrômetro de 400 MHz.NOTA: 1…

Representative Results

Masarimicina é uma pequena molécula inibidora bacteriostática de B. subtilis e S. pneumoniae e tem sido mostrado para inibir o exo-ato glcNAcase LytG em B. subtilis35,37 e atingir a parede celular em S. pneumoniae37. A masarimicina pode ser preparada eficientemente pela síntese orgânica clássica ou assistida por micro-ondas com rendimentos na faixa de 55%-70%. A síntese assistida por micro-ondas t…

Discussion

Masarimicina é um único inibidor bacteriostático micromolar de B. subtilis35 e S. pneumoniae37 . Em B. subtilis, a masarimicina tem sido demonstrada para inibir o GlcNAcase LytG35, enquanto o alvo molecular preciso na parede celular de S. pneumoniae não foi identificado37. A síntese de masarimicina usando a síntese orgânica clássica ou o procedimento de micro-ondas fornece o inibidor em bom r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência sob o número de bolsas 2009522. A análise da RMN de masarimicina foi apoiada pelo prêmio do programa de instrumentação de pesquisa da National Science Foundation sob o número de bolsas 1919644. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
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References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -. V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. 생화학. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -. H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

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Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
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