JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Syntes av masarimycin, en liten molekylhämmare av grampositiv bakterietillväxt

Published: January 07, 2022
doi:
10.3791/63191
, ,
1Department of Science and Technology,Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences,Bryant University

Summary

Ett detaljerat protokoll presenteras för beredning av den bakteriostatiska diamidmasarimycin, en liten molekylsond som hämmar tillväxten av Bacillus subtilis och Streptococcus pneumoniae genom att rikta in sig på nedbrytning av cellväggen. Dess tillämpning som en kemisk sond demonstreras i synergi/antagonismanalyser och morfologiska studier med B. subtilis och S. pneumoniae.

Abstract

Peptidoglykan (PG) i bakteriens cellvägg är en unik makromolekylär struktur som ger form och skydd mot den omgivande miljön. Centralt för att förstå celltillväxt och delning är kunskapen om hur PG-nedbrytning påverkar biosyntes och cellväggsmontering. Nyligen har den metaboliska märkningen av PG genom införandet av modifierade sockerarter eller aminosyror rapporterats. Medan kemisk förhör av biosyntetiska steg med småmolekylära hämmare är möjliga, är kemiska biologiska verktyg för att studera PG-nedbrytning av autolysiner underutvecklade. Bakteriella autolysiner är en bred klass av enzymer som är involverade i den tätt samordnade nedbrytningen av PG. Här presenteras ett detaljerat protokoll för framställning av en liten molekylsond, masarimycin, som är en hämmare av N-acetylglukosaminidas LytG i Bacillus subtilis och cellväggsmetabolism i Streptococcus pneumoniae. Framställning av hämmaren via mikrovågsassisterad och klassisk organisk syntes tillhandahålls. Dess tillämplighet som ett verktyg för att studera grampositiv fysiologi i biologiska analyser presenteras.

Introduction

Peptidoglykan (PG) är en nätliknande polymer som avgränsar cellform och struktur i både grampositiva och gramnegativa bakterier 1,2. Denna heteropolymer är en matris av aminosocker som är tvärbunden av korta peptider 3,4,5,6 med en ryggrad bestående av β-(1,4)-länkade alternerande N-acetylglukosamin (GlcNAc) och N-acetylmuraminsyra (MurNAc) rester (Figur 1)1. Fäst vid C-3-laktyldelen av MurNAc är stampeptiden. Metabolismen av PG involverar ett tätt samordnat system av biosyntetiska och nedbrytande enzymer för att införliva nytt material i cellväggen 7,8. Nedbrytning av PG utförs av enzymer som kollektivt kallas autolysiner9 och klassificeras vidare baserat på specificiteten hos den kluvna bindningen. Autolysiner deltar i många cellulära processer inklusive celltillväxt, celldelning, rörlighet, PG-mognad, kemotaxis, proteinsekretion, genetisk kompetens, differentiering och patogenicitet 10,11. Att riva upp de specifika biologiska funktionerna hos enskilda autolysiner kan vara skrämmande, delvis på grund av funktionell redundans. Nyligen genomförda biofysiska 8,12,13 och beräkningsstudier12 har dock gett ny inblick i deras roller i PG-metabolismen. Dessutom har de senaste rapporterna gett ytterligare inblick i syntesen14 och membranmedierade 15,16,17 steg i PG-metabolismen. En grundlig förståelse av förhållandet mellan nedbrytande och syntetiska vägar för PG-metabolism kan ge upphov till tidigare outnyttjade antibiotikamål.

Även om det har skett betydande framsteg i metodiken för att studera glykobiologi i eukaryoter, har bakteriell glykobiologi och i synnerhet PG-metabolism inte avancerat i samma takt. Nuvarande kemiska metoder för att studera PG-metabolism inkluderar fluorescerande märkta antibiotika18, fluorescerande sonder19,20 och metabolisk märkning 21,22,23,24. Dessa nya tillvägagångssätt ger nya sätt att förhöra bakteriell cellväggsmetabolism. Medan vissa av dessa strategier kan märka PG in vivo, kan de vara artspecifika19, eller bara fungera i stammar som saknar ett visst autolysin25. Många PG-märkningsstrategier är avsedda att användas med isolerade cellväggar26 eller med in vitro-rekonstituerade PG-biosyntesvägar 20,27,28. Användningen av fluorescerande märkta antibiotika är för närvarande begränsad till biosyntetiska steg och transpeptidering18.

Den nuvarande kunskapen om bakteriella autolysiner och deras roll i cellväggsmetabolismen kommer från genetisk och in vitro biokemisk analys 11,29,30,31,32. Även om dessa tillvägagångssätt har gett en mängd information om denna viktiga klass av enzymer, kan det vara utmanande att dechiffrera deras biologiska roll. Till exempel, på grund av funktionell redundans33, leder radering av ett autolysin i de flesta fall inte till att bakterietillväxten stoppas. Detta trots deras underförstådda roll i celltillväxt och division 7,12. En annan komplikation är att genetisk deletion av bakteriella autolysiner kan ge upphov till metafenotyper34. Metafenotyper uppstår från det komplexa samspelet mellan den väg som påverkas av den genetiska deletionen och andra sammankopplade vägar. Till exempel kan en metafenotyp uppstå via en direkt effekt som bristen på ett enzym eller en indirekt effekt såsom en störning av regulatorer.

För närvarande finns det bara ett fåtal hämmare av glykosidasautolysiner såsom N-acetylglukosaminidaser (GlcNAcase) och N-acetylmuramidaser, som kan användas som kemiska sonder för att studera nedbrytningen av PG. För att ta itu med detta har diamidmasarimycin (tidigare kallat fgkc) identifierats och karakteriserats35 som en bakteriostatisk hämmare av Bacillus subtilis tillväxt som riktar sig mot GlcNAcase LytG32 (Figur 1). LytG är en exoverkande GlcNAcase36, en medlem av kluster 2 inom glykosylhydrolasfamilj 73 (GH73). Det är den viktigaste aktiva GlcNAcase under vegetativ tillväxt32. Såvitt vi vet är masarimycin den första hämmaren av ett PG-verkande GlcNAcase som hämmar cellulär tillväxt. Ytterligare studier av masarimycin med Streptococcus pneumoniae fann att masarimycin sannolikt hämmar cellväggsmetabolismen i denna organism37. Här rapporteras beredningen av masarimycin för användning som en kemisk biologisond för att studera fysiologi i de grampositiva organismerna B. subtilis och S. pneumoniae. Exempel på morfologisk analys av subminimum hämmande koncentrationsbehandling med masarimycin, samt en synergi/antagonismanalys presenteras. Synergi- och antagonismanalyser med antibiotika med väldefinierade verkningssätt kan vara ett användbart sätt att utforska kopplingar mellan cellulära processer 38,39,40.

Protocol

1. Allmänna metoder OBS: Alla föreningar köptes från standardleverantörer och användes utan ytterligare rening. Utför tunnskiktskromatografi (TLC) på en aluminiumplatta förbelagd med kiselgel XG F254. Upptäck fläckar under en UV-lampa, genom nedsänkning i p-anisaldehydfläck eller genom att utsätta för I2-ånga. Registrera alla kärnmagnetiska resonansspektra (NMR) på en 400 MHz spektrometer.OBS: 1H-NMR och …

Representative Results

Masarimycin är en liten molekyl bakteriostatisk hämmare av B. subtilis och S. pneumoniae och har visat sig hämma den exoverkande GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 och rikta cellväggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan effektivt framställas antingen genom den klassiska eller mikrovågsassisterade organiska syntesen med utbyten i intervallet 55% -70%. Mikrovågsassisterad syntes har fördelen av en s…

Discussion

Masarimycin är en enda mikromolär bakteriostatisk hämmare av B. subtilis35 och S. pneumoniae37 tillväxt. I B. subtilis har masarimycin visat sig hämma GlcNAcase LytG35, medan det exakta molekylära målet i cellväggen hos S. pneumoniae inte har identifierats37. Syntes av masarimycin med användning av antingen den klassiska organiska syntesen eller mikrovågsproceduren ger hämmaren i gott utby…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forskningen stöddes av National Science Foundation under anslagsnummer 2009522. NMR-analys av masarimycin stöddes av National Science Foundations stora forskningsinstrumentprogramtilldelning under bidragsnummer 1919644. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter.

Materials

2-Iodobenzoic acid SIGMA-ALDRICH I7675-25G corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 109827-4L flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile SIGMA-ALDRICH 34851-4L flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates Sorbtech 4434126 silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d SIGMA-ALDRICH 151823-50G solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer Advion-Interchim Advion CMS compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile fisher chemical 07-200-90 for synergy/antagonism assays
cover slips fisher chemical 12-547 for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde CHEM-IMPEX INT'L INC. 24451 flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide SIGMA-ALDRICH 133302-5G irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine SIGMA-ALDRICH 240648-100ML corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate SIGMA-ALDRICH 537446-4L flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g) Advion-Interchim PF-50SIHP-F0012 pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde SIGMA-ALDRICH F8775-25ML fixing agent for microscopy
HEPES SIGMA-ALDRICH H8651-25G buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers SIGMA-ALDRICH 178918-4L environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer Advion expression Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac eppendorf Vacufuge plus vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 258148-2.5L corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid SIGMA-ALDRICH 320331-2.5L strong acid
immersion oil fisher chemical 12-365-19 for microscopy
Iodine, resublimed crystals Alfa Aesar 41955 environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova MestreLab Research software for processing NMR spectra
Methanol SIGMA-ALDRICH 439193-4L flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue SIGMA-ALDRICH M9140-25G microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood fisher chemical B21176X growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth fisher chemical DF0757-17-6 growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides fisher chemical 22-310397 for microscopy
Microwave Synthesis Labstation MILESTONE START SYNTH device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes SIGMA-ALDRICH Z562769-5EA 5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Bruker Ascend 400 large superconducting magnet (400MHz)
optochin fisher chemical AAB21627MC ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates Celltreat 229695 for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera Zeiss for morphology studies
puriFlash interchim XS520plus flash chromatography purification system
resazurin SIGMA-ALDRICH R7017-1G for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator Heidolph Hei-VAP Value "The Collegiate" solvent evaporator
Sodium bicarbonate SIGMA-ALDRICH S6014-500G irritant, white powder
Sodium chloride fisher chemical S271-1 crystalline, colorless
Sodium chloride SIGMA-ALDRICH S5886-500G for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate SIGMA-ALDRICH 7985592-500G anhydrous, granular, white
tryptone fisher chemical BP1421-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation Microbiology International DG250 anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract fisher chemical BP1422-500 for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software Zeiss for acquiring micrographs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -. V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660 (2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015 (2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74 (2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630 (2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. 생화학. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331 (2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652 (2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541 (2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80 (2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117 (2017).
  44. Bai, X. -. H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198 (2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Tags

MasarimycinGram-positive BacteriaAutolysin InhibitorBacterial Growth InhibitorOrganic SynthesisCyclohexylamineCyclohexyl CarboxaldehydeOrtho-iodobenzoic AcidCyclohexyl IsocyanideMethanolThin-layer ChromatographyEthyl AcetateHydrochloric AcidSodium BicarbonateSodium ChlorideSodium Sulfate
check_url/kr/63191?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gallati, M., Point, B., Reid, C. W. Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (179), e63191, doi:10.3791/63191 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image