एक एक्सेनिक कीट प्राप्त करने के लिए, इसकी अंडे की सतह को निष्फल किया जाता है, और हैच किए गए लार्वा को बाद में एक्सेनिक पत्तियों का उपयोग करके पाला जाता है। यह विधि एंटीबायोटिक दवाओं को प्रशासित किए बिना या कृत्रिम आहार विकसित किए बिना एक्सेनिक कीट तैयारी के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करती है, जिसे अन्य पत्ती खाने वाले कीड़ों पर भी लागू किया जा सकता है।
कीट की हिम्मत को विविध बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशित किया जाता है जो मेजबान के शारीरिक लक्षणों को गहराई से प्रभावित कर सकते हैं। एक एक्सेनिक कीट में एक विशेष बैक्टीरियल तनाव का परिचय आंत माइक्रोबियल फ़ंक्शन को सत्यापित करने और आंत माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन या अंडे की सतहों को स्टरलाइज़ करना कीड़ों से आंत के बैक्टीरिया को हटाने के लिए दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं। हालांकि, कीड़ों पर एंटीबायोटिक दवाओं के संभावित प्रतिकूल प्रभावों के अलावा, पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि एंटीबायोटिक दवाओं को खिलाने से आंत के बैक्टीरिया को खत्म नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, रोगाणु मुक्त कृत्रिम आहार आम तौर पर एक्सेनिक कीड़ों को बनाए रखने के लिए नियोजित किए जाते हैं, जो एक थकाऊ और श्रम-गहन प्रक्रिया है जो प्राकृतिक भोजन में पोषण संबंधी घटकों के समान पूरी तरह से नहीं हो सकती है। यहां वर्णित एक पत्ती बीटल (प्लाजियोडेरा वर्सिकोलोरा) के एक्सेनिक लार्वा को तैयार करने और बनाए रखने के लिए एक कुशल और सरल प्रोटोकॉल है। विशेष रूप से, बीटल अंडे की सतहों को निष्फल किया गया था, जिसके बाद रोगाणु मुक्त चिनार के पत्तों का उपयोग एक्सेनिक लार्वा को पीछे करने के लिए किया गया था। कीड़ों की एक्सेनिक स्थिति को संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र परख के माध्यम से और पुष्टि की गई थी। सामूहिक रूप से, अंडे कीटाणुशोधन और रोगाणु मुक्त खेती के संयोजन से, एक्सेनिक पी वर्सिकोलोरा प्राप्त करने के लिए एक कुशल और सुविधाजनक विधि विकसित की गई थी, जो अन्य पत्ती खाने वाले कीड़ों के लिए आसानी से हस्तांतरणीय उपकरण प्रदान करती है।
स्तनधारियों के समान, कीट पाचन तंत्र भोजन पाचन और अवशोषण के लिए एक गुहा है। अधिकांश कीड़े विविध कॉमेन्सल बैक्टीरिया को बंद करते हैं जो उनकी हिम्मत में पनपते हैं और मेजबान1 द्वारा आपूर्ति किए गए पोषण पर रहते हैं। आंत कम्मेन्सल समुदाय का कीड़ों में कई शारीरिक प्रक्रियाओं पर गहरा प्रभाव पड़ता है, जिसमें खाद्य पाचन और विषहरण 2,3,4, पोषण और विकास 5,6,7, रोगजनकों और परजीवी के खिलाफ रक्षा 8,9,10,11, रासायनिक संचार12,13 और व्यवहार14 शामिल हैं , 15. दिलचस्प बात यह है कि कुछ आंत माइक्रोबायोटा संकाय रूप से रोगजनक हो सकते हैं या संक्रमण को बढ़ाने के लिए रोगजनकों पर हमला करके हेरफेर किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि आंत के बैक्टीरिया कुछ मामलों में हानिकारक हो सकते हैं16,17,18। आंत बैक्टीरिया जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों और कीट प्रबंधन के लिए एक माइक्रोबियल संसाधन के रूप में भी काम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, फाइटोफैगस और ज़ाइलोफैगस कीड़ों से लिग्नोसेलुलोज-डाइजेस्टिंग बैक्टीरिया का उपयोग जैव ईंधन19 के विकास के लिए पौधों की कोशिकाओं को पचाने के लिए किया गया था। बायोएक्टिव अणुओं को व्यक्त करने वाले इंजीनियर आंत सिम्बियन्स का फैलाव कृषि और वानिकी कीटों और संक्रामक रोगों19,20,21 को प्रसारित करने वाले मच्छरों का प्रबंधन करने के लिए एक उपन्यास और आशाजनक रणनीति है, जिसका उपयोग लाभकारी कीड़ों की फिटनेस में सुधार करने के लिए भी किया जा सकता है। यह दर्शाते हुए कि विवो में एक आंत जीवाणु कैसे व्यवहार करता है, इस प्रकार इसके कार्य का पूरी तरह से लाभ उठाने और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इसका शोषण करने के लिए प्राथमिकता माना जाता है।
जानवर आंत 1 में 1 से >1000 सहजीवी माइक्रोबियल प्रजातियों को बंद कर सकतेहैं। नतीजतन, यह सटीक रूप से सत्यापित करना मुश्किल है कि व्यक्तिगत बैक्टीरियल टैक्सा या उनकी असेंबली एक जानवर के अंदर कैसे प्रदर्शन करती है, और क्या मेजबान या उसके माइक्रोबियल भागीदार एक विशिष्ट कार्य चलाते हैं। इसलिए, मोनो- या बहु-प्रजाति उपनिवेशीकरण द्वारा ग्नोटोबायोटिक कीड़े प्राप्त करने के लिए एक्सेनिक लार्वा तैयार करना बैक्टीरियल फ़ंक्शन और कीड़ों के साथ बातचीत की जांच करने के लिए आवश्यक है23. वर्तमान में, एंटीबायोटिक कॉकटेल का प्रशासन और कीट अंडे की सतह को स्टरलाइज़ करना आंतके बैक्टीरिया 14,24,25,26 को हटाने के लिए सामान्य तरीके हैं। हालांकि, एंटीबायोटिक आहार आंत के बैक्टीरिया को पूरी तरह से खत्म नहीं कर सकते हैं और मेजबान कीट शरीर विज्ञान27,28 पर नकारात्मक प्रभाव डालते हैं। नतीजतन, एंटीबायोटिक-उपचारित कीड़ों का उपयोग कुछ आंत बैक्टीरिया की वास्तविक क्षमताओं को अस्पष्ट कर सकता है। सौभाग्य से, अंडों की सतह नसबंदी इस समस्याको नकार सकती है 23,29, जिसका प्रयोगात्मक कीड़ों पर कोई या नगण्य प्रभाव नहीं पड़ता है। इसके अलावा, कृत्रिम आहार पूरी तरह से प्राकृतिक कीट भोजन जैसा नहीं हो सकता है, और कृत्रिम आहार विकसित करना एक महंगा और श्रम-उपभोग करने वाली प्रक्रिया30,31 है।
विलो लीफ बीटल, प्लागियोडेरा वर्सिकोलोरा (लाइकरिंग) (कोलोप्टेरा: क्रिसोमेलिडे), एक व्यापक पत्ती खाने वाला कीट है जो मुख्य रूप से सैलिकियस पेड़ों पर फ़ीड करता है, जैसे विलो (सैलिक्स) और चिनार (पॉपुलस एल। 32,33. यहां, विलो पत्ती बीटल का उपयोग एक प्रतिनिधि पत्ती खाने वाले कीट के रूप में किया गया था ताकि रोगाणु मुक्त कीट तैयार करने और पालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया जा सके। हमने निष्फल अंडों से पी वर्सिकोलोरा एक्सेनिक लार्वा को पीछे करने के लिए रोगाणु मुक्त चिनार पत्तियों को प्राप्त करने के लिए पौधे के ऊतक संस्कृति का शोषण किया। वर्सिकोलोरा लार्वा की एक्सेनिक स्थिति को संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र परख के माध्यम से सत्यापित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एक्सेनिक कीड़े बनाए रख सकता है जो कृत्रिम आहार के साथ कीट पालन की तुलना में जंगली स्थिति की बेहतर नकल करते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि बहुत कम लागत पर सुविधाजनक है, जो भविष्य के कीट-आंत माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन अध्ययनों के लिए एक्सेनिक कीड़े प्राप्त करने की व्यवहार्यता को बढ़ाती है, विशेष रूप से अच्छी तरह से विकसित कृत्रिम आहार के बिना गैर-मॉडल कीड़ों के लिए।
रोगाणु मुक्त लार्वा की तैयारी और विशिष्ट बैक्टीरियल उपभेदों को पुन: पेश करके ग्नोटोबायोटिक लार्वा प्राप्त करना मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31971663) और कास्ट (2020क्यूएनआरसी001) द्वारा युवा अभिजात वर्ग वैज्ञानिक प्रायोजन कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
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75% ethanol | Xingheda trade | ||
α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
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Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
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NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
Plastic box | 2.35 L | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
Vortexer | Scilogex | MX-S | |
Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |