Чтобы получить топорное насекомое, его поверхность яйца стерилизуют, а вылупившуюся личинку впоследствии выращивают с помощью акшеновых листьев. Этот метод обеспечивает эффективный способ приготовления аксенических насекомых без введения антибиотиков или разработки искусственной диеты, которая также может быть применена к другим листоядным насекомым.
Кишечник насекомых колонизирован различными бактериями, которые могут глубоко влиять на физиологические черты хозяина. Введение определенного бактериального штамма в аксеническое насекомое является мощным методом проверки микробной функции кишечника и выяснения механизмов, лежащих в основе взаимодействия кишечного микроба и хозяина. Введение антибиотиков или стерилизация поверхностей яиц являются двумя широко используемыми методами удаления кишечных бактерий от насекомых. Однако, в дополнение к потенциальному неблагоприятному воздействию антибиотиков на насекомых, предыдущие исследования показали, что кормление антибиотиками не может устранить кишечные бактерии. Таким образом, искусственные диеты без микробов, как правило, используются для поддержания топорических насекомых, что является утомительным и трудоемким процессом, который не может полностью напоминать питательные компоненты в натуральной пище. Здесь описан эффективный и простой протокол для подготовки и поддержания аксеновых личинок жука-листоеда (Plagiodera versicolora). В частности, поверхности яиц жуков были стерилизованы, после чего листья тополя без микробов использовались для выращивания личинок топоруса. Аксеновый статус насекомых был дополнительно подтвержден с помощью культурозависимых и зависящих от культуры анализов. В совокупности, сочетая дезинфекцию яиц и выращивание без микробов, был разработан эффективный и удобный метод получения аксениса P. versicolora, обеспечивающий легко переносимый инструмент для других листоядных насекомых.
Подобно млекопитающим, пищеварительный тракт насекомых является полостью для переваривания и всасывания пищи. Большинство насекомых содержат разнообразные комменсальные бактерии, которые процветают в их кишечнике и живут на питании, поставляемом хозяевами1. Комменсальное сообщество кишечника оказывает глубокое влияние на многочисленные физиологические процессы у насекомых, включая переваривание пищи и детоксикацию 2,3,4, питание и развитие 5,6,7, защиту от патогенов и паразитов 8,9,10,11, химическую связь 12,13 и поведение14 ,15. Интересно, что некоторая микробиота кишечника может быть факультативно патогенной или манипулироваться путем вторжения патогенов для усугубления инфекции, что указывает на то, что кишечные бактерии могут быть вредными в некоторых случаях 16,17,18. Кишечные бактерии также могут служить микробным ресурсом для биотехнических применений и борьбы с вредителями. Например, переваривающие лигноцеллюлозу бактерии из фитофаговых и ксилофаговых насекомых использовались для переваривания растительных клеток для разработки биотоплива19. Рассеивание инженерных кишечных симбионтов, экспрессирующих биологически активные молекулы, является новой и многообещающей тактикой для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства и комарами, передающими инфекционные заболевания 19,20,21, которые также могут быть использованы для улучшения приспособленности полезных насекомых 22. Таким образом, иллюстрация того, как кишечная бактерия ведет себя in vivo, считается приоритетом для полного использования ее функции и дальнейшего использования ее для различных применений.
Животные могут содержать от 1 до >1000 симбиотических микробных видов в кишечнике1. В результате трудно точно проверить, как отдельные бактериальные таксоны или их сборка работают внутри животного, и управляет ли хозяин или его микробные партнеры определенной функцией. Поэтому для исследования бактериальной функции и взаимодействия с насекомыми23 необходима подготовка аксеневых личинок к получению гнотобиотических насекомых путем моно- или многовидовой колонизации. В настоящее время введение антибиотических коктейлей и стерилизация поверхности яиц насекомых являются распространенными методами удаления кишечных бактерий 14,24,25,26. Однако антибиотические диеты не могут полностью устранить кишечные бактерии и оказывают негативное влияние на физиологию насекомых-хозяев27,28. Следовательно, использование обработанных антибиотиками насекомых может скрыть истинные способности некоторых кишечных бактерий. К счастью, поверхностная стерилизация яиц может свести на нет эту проблему23,29, которая не оказывает никакого или незначительного воздействия на экспериментальных насекомых. Кроме того, искусственные диеты не могут полностью напоминать натуральную пищу от насекомых, а разработка искусственной диеты является дорогостоящим и трудоемким процессом30,31.
Жук-листоед ивы, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), является широко распространенным листоядным вредителем, который в основном питается слюнными деревьями, такими как ива (Salix) и тополь (Populus L.) 32,33. Здесь жук-листоед ивы использовался в качестве представителя листоядного насекомого для разработки протокола подготовки и выращивания насекомого без микробов. Мы использовали культуру растительной ткани для получения листьев тополя без микробов для выращивания личинок P. versicolora axenic из стерилизованных яиц. Аксеновый статус личинок P. versicolora был проверен с помощью культурозависимых и зависящих от культуры анализов. Этот протокол может поддерживать акшенических насекомых, которые лучше имитируют дикие условия, чем выращивание насекомых с искусственной диетой. Что еще более важно, этот метод удобен при очень низкой стоимости, что повышает целесообразность получения аксеневых насекомых для будущих исследований взаимодействия микробиоты насекомых и кишечника, особенно для немодальных насекомых без хорошо разработанных искусственных диет.
Получение свободных от микробов личинок и получение гнотобиотических личинок путем реинтродукции специфических бактериальных штаммов являются мощными методами выяснения механизмов, лежащих в основе взаимодействия хозяина и микроба. Недавно вылупившиеся личинки получают микробиот…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (31971663) и Программой спонсорства молодых элитных ученых CAST (2020QNRC001).
0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
75% ethanol | Xingheda trade | ||
α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
Plastic box | 2.35 L | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
Vortexer | Scilogex | MX-S | |
Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |