Förbereda och föda upp axeniska insekter med vävnadsodlade plantor för värd-tarmmikrobiotainteraktionsstudier av bladbaggen
Summary
För att erhålla en axenisk insekt steriliseras dess äggyta och den kläckta larven uppföds därefter med axeniska löv. Denna metod ger ett effektivt sätt för axenisk insektsberedning utan att administrera antibiotika eller utveckla en konstgjord diet, som också kan appliceras på andra bladätande insekter.
Abstract
Insekts tarmar koloniseras av olika bakterier som kan påverka värdens fysiologiska egenskaper djupt. Att introducera en viss bakteriestam i en axenisk insekt är en kraftfull metod för att verifiera tarmens mikrobiella funktion och belysa mekanismerna bakom tarmmikrob-värdinteraktioner. Administrering av antibiotika eller sterilisering av äggytor är två vanliga metoder för att ta bort tarmbakterier från insekter. Men förutom de potentiella negativa effekterna av antibiotika på insekter, indikerade tidigare studier att utfodring av antibiotika inte kunde eliminera tarmbakterier. Således används bakteriefria konstgjorda dieter i allmänhet för att upprätthålla axeniska insekter, vilket är en tråkig och arbetsintensiv process som inte helt kan likna näringskomponenter i naturlig mat. Här beskrivs ett effektivt och enkelt protokoll för att förbereda och underhålla axeniska larver av en bladbagge (Plagiodera versicolora). Specifikt steriliserades ytorna på skalbaggsäggen, varefter bakteriefria poppelblad användes för att odla axeniska larver. Insekternas axeniska status bekräftades ytterligare via kulturberoende och kulturoberoende analyser. Sammantaget, genom att kombinera äggdesinfektion och bakteriefri odling, utvecklades en effektiv och bekväm metod för att erhålla axenisk P. versicolora, vilket ger ett lätt överförbart verktyg för andra bladätande insekter.
Introduction
I likhet med däggdjur är insektens matsmältningsorgan ett hålrum för matsmältning och absorption. De flesta insekter har olika kommensala bakterier som trivs i sina tarmar och lever på näring som levereras av värdar1. Tarmsamhället har en djupgående inverkan på flera fysiologiska processer hos insekter, inklusive matsmältning och avgiftning 2,3,4, näring och utveckling 5,6,7, försvar mot patogener och parasiter 8,9,10,11, kemisk kommunikation12,13 och beteenden14 ,15. Intressant nog kan vissa tarmmikrobiota vara fakultativt patogena eller manipuleras av invaderande patogener för att förvärra infektion, vilket indikerar att tarmbakterier kan vara skadliga i vissa fall 16,17,18. Tarmbakterier kan också fungera som en mikrobiell resurs för biotekniska tillämpningar och skadedjursbekämpning. Till exempel användes lignocellulosasmältande bakterier från fytofagösa och xylophagösa insekter för att smälta växtceller för att utveckla biobränslen19. Spridningen av konstruerade tarmsymbionter som uttrycker bioaktiva molekyler är en ny och lovande taktik för att hantera jord- och skogsbruksskadegörare och myggor som överför infektionssjukdomar 19,20,21, som också kan användas för att förbättra hälsan hos nyttiga insekter22. Att illustrera hur en tarmbakterie beter sig in vivo anses därför vara en prioritet för att fullt ut utnyttja dess funktion och ytterligare utnyttja den för olika applikationer.
Djur kan hysa 1 till >1000 symbiotiska mikrobiella arter i tarmen1. Som ett resultat är det svårt att exakt verifiera hur enskilda bakteriella taxa eller deras sammansättning fungerar inuti ett djur, och om värden eller dess mikrobiella partners driver en specifik funktion. Därför är det nödvändigt att förbereda axeniska larver för att erhålla gnotobiotiska insekter genom mono- eller flerartskolonisering för att undersöka bakteriell funktion och interaktion med insekter23. För närvarande är administrering av antibiotikacocktails och sterilisering av ytan på insektsägg vanliga metoder för att avlägsna tarmbakterier 14,24,25,26. Antibiotikadieter kan dock inte eliminera tarmbakterier helt och har en negativ effekt på värdinsektfysiologin27,28. Följaktligen kan användningen av antibiotikabehandlade insekter dölja de verkliga förmågorna hos vissa tarmbakterier. Lyckligtvis kan ytsterilisering av ägg negera detta problem23,29, vilket inte har några eller försumbara effekter på experimentella insekter. Dessutom kan konstgjorda dieter inte helt likna naturlig insektsmat, och att utveckla en konstgjord diet är en kostsam och arbetskrävande process30,31.
Pilbladbaggen, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), är en utbredd bladätande skadedjur som främst livnär sig på salicaceous träd, såsom pil (Salix) och poppel (Populus L.) 32,33. Här användes pilbladbaggen som en representativ bladätande insekt för att utveckla ett protokoll för att förbereda och föda upp en bakteriefri insekt. Vi utnyttjade växtvävnadsodling för att få bakteriefria poppelblad för att föda upp P. versicolora axeniska larver från steriliserade ägg. Den axeniska statusen för P. versicolora-larver verifierades via kulturberoende och kulturoberoende analyser. Detta protokoll kan upprätthålla axeniska insekter som bättre efterliknar det vilda tillståndet än insektsuppfödning med en konstgjord diet. Ännu viktigare är att denna metod är bekväm till en mycket låg kostnad, vilket ökar möjligheten att erhålla axeniska insekter för framtida interaktionsstudier mellan insekter och tarmmikrobiota, särskilt för icke-modellinsekter utan välutvecklade konstgjorda dieter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beredning av bakteriefria larver och erhållande av gnotobiotiska larver genom att återinföra specifika bakteriestammar är kraftfulla metoder för att belysa mekanismerna bakom värd-mikrobinteraktioner. Nykläckta larver får tarmmikrobiota på två huvudsakliga sätt: vertikal överföring från modern till avkomman eller horisontellt förvärv från syskon och miljön34. Den förstnämnda kan uppfyllas genom föräldraöverföring till avkomman genom förorening av äggytan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (31971663) och Young Elite Scientists Sponsorship Program av CAST (2020QNRC001).
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones – Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a ‘Trojan Horse’ for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).
