क्वांटम डॉट-संयुग्मित SARS-CoV-2 स्पाइक ट्रिमर्स के उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल इमेजिंग HEK293T कोशिकाओं में बाइंडिंग और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल में, पुनः संयोजक सार्स-कोव-2 स्पाइक के लिए संयुग्मित क्वांटम डॉट्स सेल-आधारित assays को प्लाज्मा झिल्ली पर hACE2 के लिए स्पाइक बाइंडिंग और साइटोप्लाज्म में बाध्य प्रोटीन के बाद के एंडोसाइटोसिस की निगरानी करने में सक्षम बनाते हैं।
Abstract
सेलुलर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए नई प्रौद्योगिकियों के विकास ने दवा की खोज के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों की सुविधा प्रदान की है। क्वांटम डॉट्स उत्कृष्ट फोटोफिजिकल गुणों के साथ फ्लोरोसेंट नैनोकणों हैं जो उज्ज्वल और स्थिर फोटोल्यूमिनेसेंस के साथ-साथ संकीर्ण उत्सर्जन बैंड के साथ प्रभावित होते हैं। क्वांटम डॉट्स आकार में गोलाकार होते हैं, और सतह रसायन विज्ञान के उचित संशोधन के साथ, सेलुलर अनुप्रयोगों के लिए बायोमोलेक्यूल्स को संयुग्मित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ये ऑप्टिकल गुण, बायोमोलेक्यूल्स के साथ उन्हें कार्यात्मक बनाने की क्षमता के साथ संयुक्त हैं, उन्हें रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन और सेलुलर तस्करी की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाते हैं। यहां, हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन के बंधन और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगात्मकवादियों के लिए एक गाइड के रूप में किया जा सकता है जो सेलुलर फिजियोलॉजी के संदर्भ में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और तस्करी का अध्ययन करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग करना चाहते हैं।
Introduction
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं को विशेष रंगों 1, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2, और क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) 3 के रूप में फ्लोरोसेंट नैनोकणों का उपयोग करके सेल के आंतरिक कामकाज में सहकर्मी बनाने में सक्षम बनाता है। 2019 (सार्स-कोव -2) वैश्विक महामारी के गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस के लिए, शोधकर्ताओं ने यह समझने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है कि वायरस प्लाज्मा झिल्ली और साइटोप्लाज्म दोनों में कोशिका के साथ कैसे बातचीत करता है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने मानव कोशिकाओं की सतह पर मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एचएसीई 2) के लिए विषाणु की सतह पर सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन के बंधन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सक्षम किया है, बाद में प्लाज्मा झिल्ली पर संलयन के माध्यम से आंतरिककरण, और स्पाइक के एंडोसाइटोसिस: एचएसीई 2 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 4,5। सेलुलर प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके लाइसोसोम के माध्यम से कोशिकाओं से सार्स-कोव -2 के उत्सर्जन में भी महान अंतर्दृष्टि प्राप्त की गई है, कोरोनोवायरस की एक अनूठी विशेषता जो पहले गोल्गी से पारंपरिक पुटिका नवोदित के माध्यम से होने के लिए सोचा गया था, क्योंकि यह कई अन्य वायरस के साथ है। जैविक अनुसंधान के लगभग सभी पहलुओं का एक मुख्य आधार, सेलुलर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक ने आवश्यक रूप से दवा स्क्रीनिंग के लिए स्वचालित उच्च-सामग्री मल्टी-पैरामीट्रिक इमेजिंग के लिए पूरे जानवरों के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग से अनुप्रयोगों की चौड़ाई और दायरे में उन्नत किया है। यहां, स्वचालित उच्च-सामग्री कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को वायरल स्पाइक प्रोटीन के लिए संयुग्मित फ्लोरोसेंट क्यूडी का उपयोग करके सार्स-कोव -2 सेल प्रविष्टि के अध्ययन के लिए लागू किया जाता है।
जैविक इमेजिंग प्लेटफार्मों द्वारा उत्पन्न छवियों का उच्च-सामग्री विश्लेषण एकल मापदंडों जैसे कि पूरी तरह से तीव्रता की तुलना में मूल्यवान जैविक अंतर्दृष्टि के अधिक निष्कर्षण की अनुमति देता है, जो एक बहु-मोडल प्लेट रीडर 7 का उपयोग करके प्राप्त करेगा। स्वचालित विभाजन एल्गोरिदम का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र में वस्तुओं को अलग करके, प्रत्येक ऑब्जेक्ट या वस्तुओं की आबादी का विश्लेषण प्रत्येक उपलब्ध प्रतिदीप्ति चैनल 8 में तीव्रता, क्षेत्र और बनावट जैसे मापदंडों के लिए किया जा सकता है। Multivariate datasets में कई मापों का संयोजन फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है। जब वांछित फेनोटाइप ज्ञात होता है, जैसे कि पंक्टा के रूप में क्यूडी आंतरिककरण, तो कोई भी उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए आकार, संख्या और तीव्रता जैसे पंक्टा से संबंधित मापों का उपयोग कर सकता है।
क्लाउड-आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म सहित विभिन्न प्रकार के इंस्ट्रूमेंट डेटा आउटपुट को समायोजित कर सकता है। छवि भंडारण और ऑनलाइन विश्लेषण के लिए क्लाउड-आधारित सर्वर का उपयोग करके, उपयोगकर्ता अपने डेटा को या तो इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट से या उस नेटवर्क ड्राइव से अपलोड करने में सक्षम है जहां डेटा संग्रहीत किया जाता है। प्रोटोकॉल का विश्लेषण भाग क्लाउड सॉफ़्टवेयर वातावरण के भीतर आयोजित किया जाता है, और डेटा को डाउनस्ट्रीम डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विभिन्न प्रकार के फ़ाइल प्रारूपों में निर्यात किया जा सकता है।
सार्स-कोव -2 वायरस गैर-संरचनात्मक और संरचनात्मक प्रोटीन से बना है जो इसकी असेंबली और प्रतिकृति में सहायता करता है। सार्स-कोव -2 स्पाइक में एस 1 और एस 2 नामक दो डोमेन हैं, जिसमें एस 1 में प्लाज्मा झिल्ली 9 पर एचएसीई 2 इंटरैक्शन के लिए जिम्मेदार रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन होता है। स्पाइक को प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य अणुओं के साथ बातचीत करने के लिए भी पाया गया है जो एचएसीई 210,11 के अलावा सह-रिसेप्टर्स के रूप में कार्य कर सकते हैं। स्पाइक प्रोटीन अनुक्रम के दौरान और विशेष रूप से S1 / S2 इंटरफ़ेस पर, प्रोटीज क्लीवेज साइटें हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन सेरीन प्रोटीज 2 (TMPRSS2) 12 के बाद झिल्ली पर संलयन को सक्षम करती हैं। विभिन्न पुनः संयोजक सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन का उत्पादन व्यक्तिगत रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन से किया गया है, एस 1, एस 2 के साथ एस 1, एस 2, और अनुसंधान गतिविधियों में उपयोग के लिए कई वाणिज्यिक विक्रेताओं से पूरे स्पाइक ट्रिमर।
इस काम में, क्यूडी की सतह को पुनः संयोजक स्पाइक ट्रिमर के साथ कार्यात्मक किया गया था जिसमें हिस्टिडीन टैग (क्यूडी-स्पाइक) होता है। नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला ऑप्टिकल नैनोमटेरियल्स अनुभाग द्वारा उत्पादित क्यूडी में एक कैडमियम सेलेनाइड कोर और एक जस्ता सल्फाइड शेल 14,15 शामिल हैं। क्यूडी सतह पर जस्ता पुनः संयोजक प्रोटीन के भीतर हिस्टिडीन अवशेषों का समन्वय करता है ताकि एक कार्यात्मक क्यूडी बनाया जा सके जो रूप और कार्य में सार्स-कोव -2 वायरल कण जैसा दिखता है। नैनोकणों और प्रोटीन संयुग्मन की पीढ़ी को पहले क्यूडी-संयुग्मित रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन 15 का उपयोग करके वर्णित किया गया था। यह विधि सेल संस्कृति की तैयारी, क्यूडी उपचार, छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जो मानव सेल के शारीरिक संदर्भ में सार्स-कोव -2 स्पाइक गतिविधि का अध्ययन करने में एक शोधकर्ता का मार्गदर्शन कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस आलेख में वर्णित विधि उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मानव कोशिकाओं में कार्यात्मक क्यूडी इमेजिंग के लिए आवश्यक चरण प्रदान करती है। यह विधि उन कोशिकाओं के लिए सबसे उपयुक्त है जहा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज, एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला ने अपने आंतरिक नैनोसाइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से धन प्रदान किया। एनआरएल कोविड-19 बेस फंड के माध्यम से अभिकर्मक तैयारी का समर्थन किया गया था।
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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