הדמיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה של מטרימי ספייק SARS-CoV-2 מצומדים קוונטיים למעקב אחר כריכה ואנדוציטוזיס בתאי HEK293T
Summary
בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.
Abstract
פיתוח טכנולוגיות חדשות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תאית הקל על שיטות סינון בתפוקה גבוהה לגילוי תרופות. נקודות קוונטיות הן חלקיקים פלואורסצנטיים עם תכונות פוטופיזיות מעולות חדורות פוטולומינציה בהירה ויציבה, כמו גם רצועות פליטה צרות. נקודות קוונטיות הן כדוריות בצורתן, ועם השינוי הנכון של כימיית פני השטח, ניתן להשתמש בהן כדי להטות ביומולקולות עבור יישומים תאיים. מאפיינים אופטיים אלה, בשילוב עם היכולת לתפקד אותם עם ביומולקולות, הופכים אותם לכלי מצוין לחקירת אינטראקציות קולטן-ליגנד וסחר תאי. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בנקודות קוונטיות כדי לעקוב אחר הכריכה והאנדוציטוזיס של חלבון ספייק SARS-CoV-2. פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך לניסויים המעוניינים לנצל נקודות קוונטיות כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר בהקשר של פיזיולוגיה תאית.
Introduction
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לחוקרים להציץ לתוך הפעולות הפנימיות של התא באמצעות צבעים מיוחדים1, חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית2, וננו-חלקיקים פלואורסצנטיים בצורה של נקודות קוונטיות (QDs)3. לתסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה של 2019 (SARS-CoV-2) המגפה העולמית, חוקרים השתמשו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבין כיצד הנגיף אינטראקציה עם התא הן בקרום הפלזמה והן בציטופלסמה. לדוגמה, חוקרים הצליחו לקבל תובנות על הכריכה של חלבון ספייק SARS-CoV-2 על פני השטח של הנגיף לאנזים אנושיים המרת אנגיוטנסין 2 (hACE2) על פני השטח של תאים אנושיים, הפנמה לאחר מכן באמצעות היתוך בקרום הפלזמה, אנדוציטוזיס של קומפלקס חלבון Spike:hACE2 4,5. תובנות נהדרות הושגו גם ליציאה SARS-CoV-2 מהתאים דרך הליזוזום באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות תאית, תכונה ייחודית של נגיפי קורונה שנחשבו בעבר להתרחש באמצעות ניצני שלפוחית מסורתיים מהגולגי, כפי שהוא עם וירוסים רבים אחרים6. טכניקת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית התאית, המהווה עמוד התווך של כמעט כל ההיבטים של המחקר הביולוגי, התקדמה בהכרח ברוחב ובהיקף היישומים שלה, החל מהדמיית סופר-רזולוציה של בעלי חיים שלמים וכלה בהדמיה רב-פרמטרית אוטומטית בעלת תוכן גבוה להקרנת סמים. כאן, מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית בעלת תוכן גבוה מוחלת על המחקר של הזנת תאים SARS-CoV-2 באמצעות QDs פלורסנט מצומדים לחלבון ספייק הנגיפי.
ניתוח תוכן גבוה של תמונות שנוצרו על ידי פלטפורמות הדמיה ביולוגית מאפשר מיצוי גדול יותר של תובנות ביולוגיות יקרות ערך מאשר פרמטרים בודדים כגון עוצמה מלאה, כי ניתן להשיג באמצעות קורא לוחות רב מודאלי7. על-ידי הפרדת האובייקטים בשדה ראייה באמצעות אלגוריתמי פילוח אוטומטיים, ניתן לנתח כל אובייקט או אוכלוסייה של אובייקטים לקבלת פרמטרים כגון עוצמה, שטח ומרקם בכל ערוץ פלואורסצנטי זמין8. שילוב מדידות רבות לתוך ערכות נתונים מרובות משתנים היא גישה שימושית עבור פרופיל פנוטיפי. כאשר הפנוטיפ הרצוי ידוע, כגון הפנמת QD בצורה של puncta, ניתן להשתמש במדידות הקשורות puncta כגון גודל, מספר, ועוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול.
תוכנה לניתוח הדמיית תוכן גבוהה מבוססת ענן יכולה להכיל מגוון גדול של יציאות נתונים של מכשירים, כולל פלטפורמת הדמיית התוכן הגבוהה. באמצעות שרת מבוסס ענן לאחסון תמונות וניתוח מקוון, המשתמש יכול להעלות את הנתונים שלו ממכשיר ההדמיה או מכונן הרשת שבו הנתונים מאוחסנים. חלק הניתוח של הפרוטוקול מתבצע בתוך סביבת תוכנת הענן, וניתן לייצא נתונים במגוון תבניות קובץ להדמיית נתונים במורד הזרם.
נגיף SARS-CoV-2 מורכב מחלבונים לא מבניים ומבניים המסייעים בהרכבו ובשכפולו. לספייק SARS-CoV-2 יש שני תחומים הנקראים S1 ו- S2, כאשר S1 מכיל את תחום איגוד הקולטן האחראי לאינטראקציות hACE2 בקרום הפלזמה9. ספייק נמצא גם לקיים אינטראקציה עם מולקולות אחרות בקרום הפלזמה שעשויות לשמש כקולטנים משותפים בנוסף hACE210,11. לאורך רצף חלבון ספייק ובמיוחד בממשק S1/S2, ישנם אתרי מחשוף פרוטאז המאפשרים היתוך בממברנה לאחר פרוטאז סרין transmembrane 2 (TMPRSS2)12. חלבונים שונים של ספייק SARS-CoV-2 רקומביננטיים הופקו מתחומים מחייבים קולטנים בודדים, ל- S1, S2, S1 עם S2, וגוזמי ספייק שלמים מספקים מסחריים מרובים לשימוש בפעילויות מחקר13.
בעבודה זו, פני השטח של QDs היה פונקציונלי עם גוזמי ספייק רקומביננטי המכילים תג היסטידין (QD-Spike). ה-QDs המיוצרים על ידי המעבדה הימית לחקר ננו-חומרים אופטיים מכילים ליבת קדמיום סלניד ומעטפת אבץ גופרתית14,15. האבץ על פני השטח של QD מתאם את שאריות ההיסטידין בתוך החלבון הרומביננטי כדי ליצור QD פונקציונלי הדומה לחלקיק נגיפי SARS-CoV-2 בצורה ובתפקוד. הדור של חלקיקים והטיית חלבון תואר בעבר באמצעות QD-מצומד קולטן מחייב domain15. שיטה זו מתארת את ההכנות לתרבות התאים, טיפול QD, רכישת תמונה ופרוטוקול ניתוח נתונים שיכול להנחות חוקר בחקר פעילות ספייק SARS-CoV-2 בהקשר הפיזיולוגי של תא אנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת במאמר זה מספקת את השלבים הדרושים להדמיית QDs פונקציונליים בתאים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה. שיטה זו מתאימה ביותר לתאים שבהם אנדוציטוזיס היא המסלול העיקרי של כניסה ויראלית ולא הפעילות של TMPRSS2 והיתוך ממברנה, כפי שהוא מאפשר את המחקר של SARS-CoV-2 ספייק ו hACE2 א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנימית של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, NIH. מעבדת המחקר הימית סיפקה מימון באמצעות המכון הפנימי שלה למדעי הננו- מדעים. הכנת ריאגנט נתמכה באמצעות קרן הבסיס NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
