Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T
Summary
Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.
Abstract
Le développement de nouvelles technologies pour la microscopie à fluorescence cellulaire a facilité les méthodes de criblage à haut débit pour la découverte de médicaments. Les points quantiques sont des nanoparticules fluorescentes avec d’excellentes propriétés photophysiques imprégnées d’une photoluminescence brillante et stable ainsi que de bandes d’émission étroites. Les points quantiques sont de forme sphérique et, avec la modification appropriée de la chimie de surface, peuvent être utilisés pour conjuguer des biomolécules pour des applications cellulaires. Ces propriétés optiques, combinées à la capacité de les fonctionnaliser avec des biomolécules, en font un excellent outil pour étudier les interactions récepteur-ligand et le trafic cellulaire. Ici, nous présentons une méthode qui utilise des points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Ce protocole peut être utilisé comme guide pour les expérimentateurs qui cherchent à utiliser des points quantiques pour étudier les interactions et le trafic protéine-protéine dans le contexte de la physiologie cellulaire.
Introduction
La microscopie à fluorescence permet aux chercheurs d’examiner le fonctionnement interne de la cellule à l’aide de colorants spécialisés1, de protéines fluorescentes génétiquement codées2 et de nanoparticules fluorescentes sous forme de points quantiques (QD)3. Pour la pandémie mondiale du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère de 2019 (SARS-CoV-2), les chercheurs ont utilisé la microscopie à fluorescence pour comprendre comment le virus interagit avec la cellule à la fois au niveau de la membrane plasmique et du cytoplasme. Par exemple, les chercheurs ont pu mieux comprendre la liaison de la protéine Spike du SRAS-CoV-2 à la surface du virion à l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) à la surface des cellules humaines, l’internalisation ultérieure par fusion au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose du complexe protéique Spike:hACE24,5. De grandes connaissances ont également été acquises sur la sortie du SARS-CoV-2 des cellules via le lysosome à l’aide de l’imagerie par fluorescence cellulaire, une caractéristique unique des coronavirus que l’on pensait auparavant se produire via le bourgeonnement traditionnel des vésicules du Golgi, comme c’est le cas avec de nombreux autres virus6. Pilier de presque tous les aspects de la recherche biologique, la technique de microscopie à fluorescence cellulaire a nécessairement progressé dans son étendue et son champ d’application, de l’imagerie à super-résolution d’animaux entiers à l’imagerie multiparamétrique automatisée à haut contenu pour le dépistage de drogues. Ici, la microscopie confocale automatisée à haute teneur est appliquée à l’étude de l’entrée des cellules du SARS-CoV-2 à l’aide de QD fluorescents conjugués à la protéine de pointe virale.
L’analyse à haut contenu des images générées par les plates-formes d’imagerie biologique permet une plus grande extraction d’informations biologiques précieuses que des paramètres uniques tels que l’intensité du puits entier, que l’on obtiendrait à l’aide d’un lecteur de plaque multimodal7. En séparant les objets dans un champ de vision à l’aide d’algorithmes de segmentation automatisés, chaque objet ou une population d’objets peut être analysé pour des paramètres tels que l’intensité, la surface et la texture dans chaque canal de fluorescence disponible8. La combinaison de nombreuses mesures dans des ensembles de données multivariés est une approche utile pour le profilage phénotypique. Lorsque le phénotype souhaité est connu, comme l’internalisation du QD sous forme de puncta, on peut utiliser les mesures liées au puncta telles que la taille, le nombre et l’intensité pour évaluer l’efficacité d’un traitement.
Le logiciel d’analyse d’imagerie à haut contenu basé sur le cloud peut accueillir une grande variété de sorties de données d’instruments, y compris la plate-forme d’imagerie à haut contenu. En utilisant un serveur basé sur le cloud pour le stockage d’images et l’analyse en ligne, l’utilisateur peut télécharger ses données à partir de l’instrument d’imagerie ou du lecteur réseau où les données sont stockées. La partie analyse du protocole est effectuée dans l’environnement logiciel cloud, et les données peuvent être exportées dans une variété de formats de fichiers pour la visualisation des données en aval.
Le virus SARS-CoV-2 est composé de protéines non structurelles et structurelles qui aident à son assemblage et à sa réplication. Le pic du SRAS-CoV-2 a deux domaines appelés S1 et S2, S1 contenant le domaine de liaison aux récepteurs responsable des interactions hACE2 au niveau de la membrane plasmique9. Spike a également été trouvé pour interagir avec d’autres molécules à la membrane plasmique qui peuvent agir comme co-récepteurs en plus de hACE210,11. Tout au long de la séquence protéique de pointe et en particulier à l’interface S1/S2, il existe des sites de clivage de la protéase qui permettent la fusion au niveau de la membrane après la sérine transmembranaire protéase 2 (TMPRSS2)12. Diverses protéines recombinantes de spike du SARS-CoV-2 ont été produites à partir de domaines de liaison de récepteurs individuels, à S1, S2, S1 avec S2 et à des trimères de pointe entiers de plusieurs fournisseurs commerciaux pour une utilisation dans des activités de recherche13.
Dans ce travail, la surface des QD a été fonctionnalisée avec des trimères de pointes recombinants contenant une étiquette d’histidine (QD-Spike). Les QD produits par naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contiennent un noyau de séléniure de cadmium et une coque de sulfure de zinc14,15. Le zinc à la surface du QD coordonne les résidus d’histidine dans la protéine recombinante pour former un QD fonctionnalisé qui ressemble à une particule virale du SARS-CoV-2 dans sa forme et sa fonction. La génération des nanoparticules et la conjugaison des protéines ont été décrites précédemment à l’aide du domaine de liaison au récepteur conjugué QD15. Cette méthode décrit les préparations de culture cellulaire, le traitement QD, l’acquisition d’images et le protocole d’analyse de données qui peuvent guider un chercheur dans l’étude de l’activité du pic du SRAS-CoV-2 dans le contexte physiologique d’une cellule humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans cet article fournit les étapes nécessaires pour l’imagerie de QD fonctionnalisés dans des cellules humaines à l’aide de la microscopie confocale à haut débit. Cette méthode convient mieux aux cellules où l’endocytose est la principale voie d’entrée virale plutôt que l’activité de TMPRSS2 et de fusion membranaire, car elle permet d’étudier le PIC SARS-CoV-2 et l’endocytose hACE2. En raison de la nature du modèle QD et de l’étiquette His-terminal C sur le trimer Spike…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue en partie par le programme de recherche intra-muros du National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Le Naval Research Laboratory a fourni un financement par l’intermédiaire de son Institut interne de nanosciences. La préparation des réactifs a été soutenue par le fonds de base NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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