A microscopia de três fótons permite imagens de fluorescência de alto contraste profundamente em tecidos biológicos vivos, como cérebros de camundongos e zebrafish, com alta resolução espacial.
As técnicas de microscopia multifotúr, como microscopia de dois fótons (2PM) e microscopia de três fótons (3PM), são ferramentas poderosas para imagens in vivo de tecido profundo com resolução subcelular. 3PM tem duas grandes vantagens para a imagem de tecido profundo acima de 2PM que tem sido amplamente utilizado em laboratórios de biologia: (i) maior comprimento de atenuação em tecidos de dispersão, empregando ~1.300 nm ou ~1.700 nm laser de excitação; (ii) menor geração de fluorescência de fundo devido à excitação não linear de alta ordem. Como resultado, o 3PM permite imagens estruturais e funcionais de alto contraste profundamente dentro de tecidos de dispersão, como cérebro de rato intacto das camadas corticais para o hipocampo e todo o cérebro de zebrafish adulto.
Hoje, fontes de laser adequadas para 3PM estão disponíveis comercialmente, permitindo a conversão de um sistema de imagem de dois fótons (2P) existente para um sistema de três fótons (3P). Além disso, vários microscópios comerciais 3P estão disponíveis, o que torna essa técnica prontamente disponível para laboratórios de pesquisa em biologia. Este artigo mostra a otimização de uma configuração típica de 3PM, particularmente visando grupos de biologia que já possuem uma configuração 2P, e demonstra imagens 3D intravital em cérebros de camundongos intactos e zebrafish adultos. Este protocolo abrange o procedimento experimental completo de imagens 3P, incluindo alinhamento de microscópio, pré-chir de ~1.300 e ~1.700 nm de pulsos laser, preparação animal e imagens de fluorescência intravital 3P profundas em zebrafish adultos e cérebros de camundongos.
Na ciência da vida, técnicas de microscopia multifotual (MPM), como 14h e 15h, têm sido ferramentas poderosas para imagens profundas in vivo com alta resolução espacial e alto contraste em tecidos de dispersão. Além disso, esses métodos causam menos fotobleaching quando comparados à microscopia confocal de um fóton 1,2,3,4. 3PM é vantajoso para imagens de tecido mais profundo quando comparado com 2PM devido a duas características principais: (i) o emprego de excitação de comprimento de onda mais longo (~1.300 nm ou ~1.700 nm) reduz a dispersão tecidual, e (ii) o processo de excitação de ordem superior (ou seja, o sinal de fluorescência depende do cubo do poder de excitação em 3PM em vez do quadrado do poder de excitação em 2PM) que suprime a fluorescência de fundo indesejada3 . Consequentemente, o 3PM permite imagens de alto contraste em regiões mais profundas em tecidos vivos, como o hipocampo em um cérebro de camundongo adulto intacto 3,5,6,7,8,9,10,11 e todo o cérebro de zebrafish adulto12, incluindo Ca2+ registro de atividades e observações multicoloridas. Além disso, imagens de alto contraste foram obtidas com 3PM através dos crânios intactos de camundongos e zebrafishadultos 12,13.
Hoje, fontes de laser de excitação adequadas para excitação 3P (3PE) a ~1.300 e ~1.700 nm estão disponíveis comercialmente. Como o sistema de varredura a laser é essencialmente o mesmo para 14:00 e 15:00, a conversão de uma configuração 2P existente em uma configuração 3P é possível em laboratórios de biologia com a instalação de um laser comercialmente disponível para 3PE. O sinal de fluorescência 3P depende da potência do laser, duração do pulso, taxa de repetição do laser e abertura numérica (NA) da lente objetiva. Assumindo um foco limitado de difração (ou seja, a abertura traseira da lente objetiva é superabastecida pelo feixe de excitação), Eq (1) descreve o fluxo de fótons de fluorescência mediana do volume focal resultante do 3PE.
(1)
Quando f é a taxa de repetição do laser, τ é a duração do pulso do laser (largura total à metade do máximo), φ é a eficiência de coleta do sistema, η é a eficiência quântica da fluorescência, σ3 é a seção transversal de absorção 3P, C é a concentração fluorhoreop, n0 é o índice reflexivo do meio amostral (por exemplo, água), λ é a onda de excitação no vácuo, Na é a abertura numérica da lente objetiva, um3 é a constante de integração espacial do volume focal, é o fluxo de fóton de excitação (fótons/s) com média de tempo sob a lente objetiva, z é a profundidade imagem, e EAL é o comprimento de atenuação eficaz14. Aqui assumimos que o EAL (tipicamente > 100 μm) é muito maior do que a resolução axial do microscópio (tipicamente < 10 μm). Sob aproximação paraxial, um3 é igual a 28.114. g(3) é a coerência temporal de3ª ordem da fonte de excitação, e gp(3) é 0,41 e 0,51 para pulsos hiperbólicos-secant-quadrados e pulsos gaussianos, respectivamente. A eficiência da coleta φ pode ser estimada considerando a coleta de fluorescência pela lente objetiva, transmissão da lente objetiva, a refletividade do espelhodicróico, a transmissão dos filtros e a eficiência de detecção do detector (por exemplo, tubo fotomultiplier ou PMT). Como a intensidade de fluorescência 3P é altamente dependente de vários parâmetros, a otimização da configuração 3P é necessária para maximizar os sinais de fluorescência 3P.
Este protocolo ilustra o processo de otimização de uma configuração típica de 3P, que será útil especialmente para laboratórios de biologia que têm uma configuração 2P e planejam expandir sua capacidade para imagens 3P ou manter sua configuração comercial 3P em ótimo desempenho. Este artigo de vídeo também demonstra imagens 3P de tecido profundo em cérebros animais vivos. A primeira seção aborda a otimização de uma configuração típica de 3P com uma fonte laser comercialmente disponível e microscópio multifotônio. A segunda e terceira seções descrevem a preparação de zebrafish e camundongos, respectivamente, para 3PM de estruturas e atividades neuronais. A cirurgia de craniotomia do camundongo foi previamente relatada em documentos de protocolo, bem como 15,16,17. A quarta seção demonstra imagens intravital 3P em zebrafish e cérebros de camundongos.
Este protocolo explica os procedimentos passo a passo para a configuração de imagens 3P com uma fonte comercial de microscópio e laser. Em comparação com as 14h, o 3PM tem uma vantagem em aplicações que requerem acesso óptico nas regiões mais profundas, como no hipocampo cerebral do camundongo. Embora o 3PM seja usado principalmente na neurociência, o 3PM pode ser potencialmente aplicado em outros tecidos, como linfonodos, ossos e tumores para observação de tecidos profundos.
É importante verificar se o sistema de imagem funciona próximo ao limite de ruído de tiro, o que garante que os eletrônicos de detecção e aquisição de dados contribuam com ruídos insignificantes para a imagem após os PMTs. A incerteza no número de fótons detectados é fundamentalmente limitada pelo ruído de tiro de fóton. O desempenho limitado com ruído de tiro pode ser alcançado em um microscópio multifotônio típico usando um fotodetetor de alto ganho (por exemplo, um PMT). O ruído do tiro de fóton segue uma distribuição estatística de Poisson, em que o desvio padrão da distribuição é igual à raiz quadrada da média da distribuição. Para verificar o desempenho limitado do ruído de tiro, siga o passo 1.14 na seção protocolo.
Para evitar atenuação leve por H2O, usar D2O para imersão é útil, particularmente para a excitação de ~1.700 nm. Quando D2O é usado, é essencial atualizar D2O a cada ~10 min ou usar um grande volume de D2O para evitar d2O/H2O troca durante a imagem. Pode-se também selar o D2O do ambiente da sala3. Se uma lente objetiva de longa distância de trabalho (WD) (por exemplo, WD a 4 mm ou mais) for usada para imagem, a espessura líquida de imersão pode exceder 2-3 mm. O aumento da espessura torna a absorção H2O não desprezível mesmo em ~1.300 nm21. Portanto, D2O pode ser necessário mesmo para 1.300 nm 3PM ao usar uma lente objetiva WD longa.
Como a intensidade da fluorescência 3P depende do cubo da energia do pulso de excitação no foco (Eq. (1)), definir a potência laser apropriada é particularmente importante para obter sinais adequados de fluorescência 3P, evitando danos térmicos e não lineares nos tecidos vivos. A potência média do laser deve ser mantida abaixo do limiar de dano térmico. No cérebro do camundongo, por exemplo, para evitar danos nos tecidos térmicos, a potência média na superfície cerebral do camundongo deve ser mantida em ou abaixo de ~100 mW para excitação de ~1.300 nm a uma profundidade de 1 mm e com um campo de visão (FOV) de 230 μm x 230 μm21. Da mesma forma, a potência média em ~1.700 nm deve ser mantida em ou abaixo de ~50 mW a ~1 mm de profundidade e um FOV de ~230 μm x 230 μm (dados inéditos). Além disso, para evitar a saturação da excitação e possíveis danos não lineares, a energia de pulso de excitação deve ser mantida em 2 nJ e
3 nJ por ~1.300 nm e ~1.700 nm excitação, respectivamente30.
Devido à absorção de luz e dispersão nos tecidos, a energia do pulso em foco é atenuada a 1/e (~37%) após a penetração de tecidos por 1 EAL. O EAL varia em diferentes tecidos e com os comprimentos de onda de excitação, por exemplo, no neocórtex do cérebro do camundongo, o EAL é ~300 μm e ~400 μm a ~1.300 nm e ~1.700 nm, respectivamente 3,29 (Figura 5). Portanto, para manter a mesma energia de pulso em foco (por exemplo, 1 nJ/pulso) a uma profundidade de n EALs, a energia de pulso da superfície precisa ser multiplicada por 1 nJ × en. Para imagens rápidas de dinâmica estrutural e funcional, um laser de excitação com uma alta taxa de repetição (a 1 MHz ou superior) é desejável alcançar uma alta taxa dequadros 5,6,7,10. No entanto, a exigência de energia de pulso e o limite médio de energia do laser restringem a taxa de repetição aplicável.
Por exemplo, quando percebemos uma região moderadamente profunda em 4 EALs (ou seja, ~1,2 mm no córtex do mouse com excitação de 1.300 nm), ~55 nJ/pulso na superfície é necessário para manter 1 nJ/pulso em foco. Quando a limitação média de energia é de 100 mW, podemos aplicar uma taxa de repetição de laser de ~2 MHz. No entanto, para imagem mais profunda a uma profundidade de 7 EALs, ~1.100 nJ/pulse é necessário na superfície para manter 1 nJ/pulso em foco. Supondo que a potência média máxima seja de 100 mW para evitar danos térmicos, a taxa de repetição do laser deve ser reduzida para 0,1 MHz para alcançar um 1.100 nJ/pulso na superfície. A Tabela 1 resume as condições típicas de imagem no córtex cerebral do camundongo. Observe que as profundidades de imagem na Tabela 1 assumem que o EAL é uniforme em todo o córtex do mouse.
Além disso, devido à limitação de energia do laser no tecido profundo 3PM, existe uma troca entre a taxa de quadros e o tamanho do pixel de imagem, o que é particularmente importante para imagens funcionais, como a imagem de cálcio. A taxa máxima de repetição do laser disponível é decidida em cada profundidade com base na energia de pulso necessária em foco e na potência média de laser aplicável como discutido acima, por exemplo, 2 MHz a uma profundidade equivalente a ~4 EALs com excitação de 1.300 nm. Em geral, a imagem requer pelo menos um pulso por pixel. Assim, o tempo mínimo disponível para o pixel é determinado pela taxa de repetição do laser, por exemplo, 0,5 μs/pixel com excitação de 2 MHz.
Para manter a alta resolução espacial (~1 μm na lateral) em imagens 3P, é ideal definir 1 pixel para uma área de ~1 μm2, por exemplo, 256 x 256 pixels para um FOV de 250 x 250 μm2. Assim, para realizar imagens rápidas com um FOV consideravelmente grande (por exemplo, 250 x 250 μm2 com 256 x 256 pixels), taxas de repetição de pulso de 0,5 MHz, 1 MHz e 2 MHz dão taxas teóricas de quadros máximos de ~7,6, ~15 e ~30 quadros/s, respectivamente. Da mesma forma, a otimização da taxa de repetição do laser é essencial, dependendo da profundidade do alvo, velocidade de varredura e FOV, para aplicar energia de pulso adequada sob o limiar de dano térmico. Para aumentar a velocidade de imagem, uma fonte de excitação adaptativa pode ser usada para concentrar todos os pulsos de excitação nos neurônios (ou seja, regiões de interesse) fornecendo pulsos laser sob demanda para os neurônios31.
3PM é vantajoso quando comparado com 2PM em imagens profundas dentro de tecidos vivos e através de mídias altamente dispersas, como um crânio, ossos e a camada de matéria branca (ou seja, a cápsula externa) do cérebro do camundongo. O EAL mais longo e a excitação não linear de 3PE beneficia a imagem de tecido profundo. Por exemplo, para imagem GCaMP6 no córtex do mouse, o sinal de fluorescência 2P com excitação de 920 nm é maior que o sinal de fluorescência de 3P com excitação de 1.300 nm em regiões rasas a 690 μm (ou seja, ~2,3 EALs a 1.300 nm)21. No entanto, devido ao EAL mais longo em 1.300 nm em comparação com 920 nm, 3PE dá fluorescência mais forte do que excitação 2P (2PE) a uma profundidade de ~690 μm emais profundo 21. Esta profundidade é definida como “profundidade de crossover de sinal”, na qual os pontos fortes do sinal de fluorescência de 2PE e 3PE são idênticos com a mesma taxa de repetição e os mesmos poderes médios permitidosmáximos 21. A profundidade do cruzamento de sinal depende dos comprimentos de onda de excitação para 2PE e 3PE e o fluoróforo.
Na prática, a excitação de 920 nm permite maior potência média do laser do que 1.300 nm excitação devido à menor absorção de água. No entanto, a maior potência média de 2PE empurraria a profundidade do crossover de sinal apenas em 0,9 EALs4. Além disso, quando a amostra é densamente rotulada, o 3PE tem a vantagem adicional de SBR muito maior. Portanto, mesmo antes de atingir o comprimento do crossover do sinal, o 3PM pode ser melhor para imagens do que 14:00. Por exemplo, ao imaginar a vasculatura cerebral do camundongo, que tem uma fração de volume (ou seja, densidade de rotulagem) de ~2%, 1.300 nm 3PM com poder de excitação de 100 mW supera 920 nm 2PM com 200 mW de poder de excitação a uma profundidade de ~700 μm para fluoresceína.
3PM também tem uma vantagem ao fotografar através de uma camada fina, mas altamente dispersa que pode distorcer a função de propagação de pontos do feixe de excitação e gerar um fundo de desfocal4. Por exemplo, através do crânio intacto do cérebro do camundongo, as imagens das 2PM sofrem do fundo de desfoco mesmo na profundidade rasa de <100 μm da superfície cerebral13. Um fundo de desfoco semelhante foi observado em 2PM com excitação de 1.280 nm através da matéria branca no cérebro do camundongo32. Portanto, quando os tecidos são imagens através de camadas turvas, 3PM é preferível às 14:00 para imagens de alto contraste, independentemente da densidade de rotulagem.
Recentemente, relatamos uma análise fantasma e teórica de contas mostrando que o limite de profundidade de imagem de 3PM é superior a 8 EALs33; 8 EALs são equivalentes a ~3 mm com ~1.700 nm de excitação no córtex do mouse. No entanto, o laser atualmente disponível não tem energia de pulso suficiente para alcançar 8 EALs no cérebro do camundongo. O desenvolvimento adicional de lasers mais fortes empurrará o limite atual de profundidade de imagem de 3PM.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub e NIH 1U01NS103516.
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |