In vitro Caractérisation des chaperons de histones à l’aide d’essais analytiques, de rabattement et de chaperoning
Summary
Ce protocole décrit une batterie de méthodes qui comprend la chromatographie analytique taille-exclusion pour étudier l’oligomérisation et la stabilité des histones chaperones, le test pull-down pour démêler les interactions hiperon-histone, l’ASC pour analyser la stœchiométrie des complexes protéiques et le test de chaperonnage des histones pour caractériser fonctionnellement un chaperon histones putatif in vitro.
Abstract
Les protéines d’histone s’associent à l’ADN pour former la chromatine eucaryote. L’unité de base de la chromatine est un nucléosome, constitué d’un octamère d’histones constitués de deux copies des histones centrales H2A, H2B, H3 et H4, enroulées par l’ADN. L’octamère est composé de deux copies d’un dimère H2A/H2B et d’une seule copie d’un tétramère H3/H4. Les histones du noyau hautement chargées sont sujettes à des interactions non spécifiques avec plusieurs protéines du cytoplasme cellulaire et du noyau. Les chaperons d’histones forment une classe diversifiée de protéines qui transportent les histones du cytoplasme dans le noyau et facilitent leur dépôt sur l’ADN, facilitant ainsi le processus d’assemblage des nucléosomes. Certains chaperons d’histones sont spécifiques pour H2A/H2B ou H3/H4, et certains fonctionnent comme chaperons pour les deux. Ce protocole décrit comment des techniques de laboratoire in vitro telles que les essais de pull-down, la chromatographie analytique d’exclusion de la taille, l’ultracentrifugation analytique et le test de chaperonnage des histones pourraient être utilisées en tandem pour confirmer si une protéine donnée est fonctionnelle en tant que chaperon d’histones.
Introduction
Les nucléosomes composés d’ADN et de protéines histones forment l’unité structurelle de la chromatine et régulent plusieurs événements cellulaires critiques. Les nucléosomes sont repositionnés et remodelés dynamiquement pour rendre l’ADN accessible à divers processus tels que la réplication, la transcription et la traduction 1,2. Les histones qui sont très basiques ont tendance à interagir avec les protéines acides dans le milieu cellulaire ou subissent une agrégation, conduisant ainsi à divers défauts cellulaires 3,4,5. Un groupe de protéines dédiées appelées chaperons d’histones aide au transport des histones du cytoplasme vers le noyau et prévient les événements aberrants d’agrégation histone-ADN 6,7. Fondamentalement, la plupart des chaperons d’histones stockent et transfèrent les histones sur l’ADN à une force ionique physiologique, facilitant ainsi la formation de nucléosomes 8,9. Certains chaperons d’histones ont une nette préférence pour les oligomères d’histones H2A/H2B ou H3/H410.
Les chaperons d’histones sont caractérisés en fonction de leur capacité à assembler des nucléosomes dépendants ou indépendants de la synthèse de l’ADN11. Par exemple, le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est dépendant tandis que le régulateur d’histones A (HIRA) est indépendant de la synthèse de l’ADN12,13. De même, la famille des nucléoplasmines des chaperons d’histones est impliquée dans la décondensation de la chromatine des spermatozoïdes et l’assemblage des nucléosomes14. Les membres de la famille des protéines d’assemblage des nucléosomes (NAP) facilitent la formation de structures de type nucléosome in vitro et sont impliqués dans la navette des histones entre le cytoplasme et le noyau15. Les nucléoplasmines et les protéines de la famille NAP sont toutes deux des chaperons fonctionnels des histones, mais ne partagent aucune caractéristique structurelle. Essentiellement, aucune caractéristique structurelle unique ne permet la classification d’une protéine comme chaperond’histones 16. L’utilisation d’essais fonctionnels et biophysiques ainsi que d’études structurelles fonctionne mieux pour caractériser les chaperons d’histones.
Ce travail décrit des méthodes biochimiques et biophysiques pour caractériser une protéine en tant que chaperon d’histones qui facilite l’assemblage des nucléosomes. Tout d’abord, une chromatographie analytique d’exclusion de taille a été réalisée pour analyser le statut oligomère et la stabilité des chaperons d’histones. Ensuite, un test de pull-down a été effectué pour déterminer les forces motrices et la nature compétitive des interactions hiperon-histone. Cependant, les paramètres hydrodynamiques de ces interactions n’ont pas pu être calculés avec précision à l’aide de la chromatographie analytique taille-exclusion en raison de la forme de la protéine et de ses complexes qui ont un impact sur leur migration à travers la colonne. Par conséquent, l’ultracentrifugation analytique a été utilisée, qui fournit des propriétés macromoléculaires en solution qui incluent un poids moléculaire précis, la stœchiométrie de l’interaction et la forme des molécules biologiques. Des études antérieures ont largement utilisé le test de chaperonnage in vitro des histones pour caractériser fonctionnellement les chaperons d’histones tels que yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Le test de chaperonnage des histones a également été utilisé pour caractériser fonctionnellement les protéines en tant que chaperons d’histones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail démontre et valide un ensemble complet de protocoles pour la caractérisation biochimique et biophysique d’un chaperon putatif d’histones. Ici, des protéines de la famille NAP exprimées et purifiées par recombinaison, AtNRP1 et AtNRP2, et le domaine nucléoplasmine N-terminal d’AtFKBP53 ont été utilisés pour démontrer les protocoles. Le même ensemble d’expériences pourrait très bien être utilisé pour délimiter les attributs fonctionnels des chaperons d’histones non caractérisés aupara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les subventions extra-muros accordées à Dileep Vasudevan par le Science and Engineering Research Board, gouvernement indien [CRG/2018/000695/PS] et le Département de la biotechnologie, ministère de la Science et de la Technologie, gouvernement de l’Inde [BT/INF/22/SP33046/2019], ainsi que le soutien intra-muros de l’Institut des sciences de la vie, Bhubaneswar, sont grandement appréciés. Nous remercions Mme Sudeshna Sen et Mme Annapurna Sahoo pour leur aide dans la préparation des histones. Les discussions avec nos collègues, le Dr Chinmayee Mohapatra, M. Manas Kumar Jagdev et le Dr Shaikh Nausad Hossain, sont également reconnues.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
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